【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 强直性脊柱炎；免疫球蛋白；自噬蛋白；自噬基因；自噬通路
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正文：
摘要：目的:分析39例强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)患者和31例健康体检者的血清免疫球蛋白（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、SIgA、IgM）、淋巴细胞自噬蛋白Beclin1 、自噬指标微管相关蛋白l轻链(LC3-II)、磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)、AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、血清自噬相关基因：Atg1、Atg5、Atg12、Atg13、Atg17，观察上述指标的变化并对其相关因素进行分析。方法: 将39例强直性脊柱炎患者列为实验组，另设31例正常健康人为对照组，采用Elisa方法检测两组人员的血清免疫球蛋白（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、SIgA、IgM），运用Western blot检测两组成员的淋巴细胞自噬蛋白Beclin1、LC3-II、PI3K、AKT、mTOR的变化，利用PCR方法检查血清自噬相关基因：Atg1、Atg5、Atg12、Atg13、Atg17，并分析各指标之间的相关性。结果:（1）两组比较IgG1、IgG4、IgA、SIgA较健康对照显著升高（P<0.05或P<0.01）；两组IgG2、IgG3、IgM无明显变化（2）两组比较PI3K、mTOR较健康对照明显升高，具有统计学意义（P<0.01）。两组Beclin1、LC3-II、AKT无明显差异。（3）两组比较ATG1、ATG12、ATG13、ATG17较健康对照明显升高，ATG5较健康对照明显降低，具有统计学意义（P<0.01）。（4）相关分析结果显示, AS患者IgG1、IgG2、IgG3、IgG4与mTOR呈正相关，SIgA与Beclin1呈正相关；IgG1、IgA、IgM与AKT呈正相关；免疫球蛋白各亚型与LC3-II、PI3K，无明显相关性。AS患者IgG1、IgG2、IgG3、IgA、SIgA、IgM与ATG17呈负相关，IgG4与ATG17呈正相关；免疫球蛋白各亚型与ATG1、ATG5、ATG12、ATG13无明显相关性。
结论:AS患者存在免疫球蛋白、细胞自噬蛋白、细胞自噬基因指标的变化，且各项指标存在一定的相关性。
关键词：强直性脊柱炎；免疫球蛋白；自噬蛋白；自噬基因；自噬通路
AS是以骶髂关节和脊柱关节慢性、进行性炎性病变为主的自身免疫性疾病，骶髂关节受累和附着点炎为其特点。AS多发于青壮年男性，其患病率较高，国内报道约为0.3%[1]。既往研究表明多项免疫学指标异常[2]。自噬作用引起自身免疫耐受可防止自由免疫性疾病的发生，自噬功能异常与免疫疾病的发生有关[3]。自噬通路如何限制病原体入侵、活化免疫系统、提呈抗原给T 细胞以及维持T 细胞和B 细胞的功能, 研究自噬与免疫应答的相互作用, 为疾病过程中调节免疫应答或免疫耐受提供了可能性。目前有很多证据显示自噬对机体还具有保护性作用, 自噬能够维持肌体对自身组织的免疫耐受[4]。以自噬作为靶点治疗免疫相关疾病已经成为目前研究的热点。强直性脊柱炎作为一种常见的自身免疫性疾病，其与细胞自噬的研究目前尚少。
本文通过检测39例AS患者和31例健康体检者的免疫球蛋白亚型、Beclin1、LC3-II、PI3K 、AKT、mTOR、Atg1、Atg5、Atg12、Atg13、Atg17，并对各项指标进行分析，从细胞自噬角度，结合免疫球蛋白，研究强直性脊柱炎，以便为临床提供指导意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究选择从2013年10月至2014年3月于安徽省中医院风湿免疫科住院的39位AS患者为实验组，所有患者均符合1984年美国风湿病协会修订的强直性脊柱炎或2009年中轴性脊柱关节病的诊断标准[5]，均排除合并心血管、肝肾和造血系统或其他自身免疫性疾病等严重原发性疾病以及精神病患者。共入选AS患者39例，其中男31例（79.5﹪），女8例（20.5%），男：女为3.9：1, 年龄15-65岁，平均( 33.15±11. 24) 岁，病程1月-40年，平均（6.51±6.86）年。另选择同一时期31例健康体检者作为健康对照组，其中男女比例、年龄与AS患者组差异无统计学意义( P＞0.05)。
1.2 研究方法
1.2.1 标本采集    所有被选对象均于清晨空腹时静脉采血10 ml，室温下静置2h后，3000r／min离心15min，分离出血清，后集中放于－20℃冰箱直至使用。
1.2.2.1 指标检测    IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、SIgA、IgM的测定均采用ELISA试剂盒（南京建成分装进口，批号分别为：E-13085、E-13086、E-13087、E-13087、E-11511、E-11457、E-11513）进行检测，严格按照说明书进行操作。用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
1.2.2.2   均于晨起后采所有被选对象10ml全血取血，置于2个抗凝管中，加入等量的淋巴细胞分离液于离心管中，沿着管壁缓慢加入血标本；放置于水平梯度离心机中离心（2000r/20min）处理后，可见分为四层，其中云雾状层，为单个核细胞层；吸取该层置试管中，加入等量的PBS冲洗两次（1500r/5min），贮存于EF管内，放置于-80℃的冰箱中保存，以用于WB观察。整个采集过程不得超过2小时。Western blo方法分别经过：组织匀浆及蛋白的提取；电泳； 转膜； 封闭；一抗孵育；二抗孵育；蛋白检测。Beclin1、LC3-II、PI3K、AKT、mTOR厂家分别为：abcam公司、SANTA公司、Bioworld公司；批号分别为：ab62472、Sc-271625、bs-3006、 bs-1810、 bs-3611。
1.2.2.3 淋巴细胞的采取方法同上。荧光定量实验方法分别经过：RNA提取；RT反应；荧光定量PCR反应；加入各指标荧光定量引物序列；结果分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析，计量资料采用(±S)表示，相关性分析采用Spearman相关分析，以P<0.05或P<0. 01具有统计学意义。
2 结果
2.1  39例AS患者和31例健康体检者免疫球蛋白亚型的情况（表1）
    两组比较IgG1、IgG4、IgA、SIgA较健康对照显著升高（P<0.05或P<0.01）；两组IgG2、IgG3、IgM无明显变化。
               表1  两组免疫球蛋白的变化(）
细胞因子
AS组（n=39）
健康对照组（n=31）

IgG1（μg/ ml）
63.005±50.753▲▲
25.077±23.308

IgG2（μg/ ml）
27.561±22.697
21.801±6.675

IgG3（μg/ ml）
12.266±11.638
8.719±3.090

IgG4（μg/ ml）
33.991±33.100▲
20.354±11.213

IgA（μg/ ml）
12.820±11.525▲▲
2.435±4.312

SIgA（μg/ ml）
32.532±35.610▲
15.100±9.901

IgM（μg/ ml）
16.042±12.947
11.917±5.399

注： 与健康对照组比较▲▲P<0.01；▲P<0.05。
 
2.2  39例AS患者和31例健康体检者细胞自噬蛋白相关指标的情况（表 2）
    两组比较PI3K、mTOR较健康对照明显升高，具有统计学意义（P<0.01）。两组Beclin1、LC3-II、AKT无明显差异。
表2  两组成员细胞自噬相关蛋白指标的情况(）
细胞自噬指标
AS（n=39）             健康对照组 （n=31）

Beclin1
0.212±0.578                0.439±0.045

LC3-II
0.166±0.545                0.613±0.154

PI3K

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