摘要：建立同时分离和测定五种喹诺酮类药物(洛美沙星，噁喹酸，氟甲喹，加替沙星，单诺沙星)的高效液相色谱分析方法。本实验采用VP-ODS色谱柱柱(150 mm ´ 4.6 mm, 5.0 mm)，以甲醇-0.03mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液(体积比为50：50，pH=6.8)为流动相，流速为1.0 mL/min和紫外检测波长设定为265 nm。在最佳实验条件下，五种喹诺酮类药物色谱峰的峰面积与它们的浓度在0.05 ~ 50.0μg/mL范围成良好线性，最低检测限为0.003 ~ 0.005 μg/mL。本方法简便、快速、灵敏度高，并运用于鸡体内该五种喹诺酮类药物的血药浓度的测定。

　　关键词：反相高效液相色谱，鸡血浆，氟喹诺酮。

　　1引 言

　　体内药物分析是借助多种分离、分析的手段来了解药物在体内数量和质量的变化，得到药物代谢动力学的各种参数和转变、代谢的途径等信息;探究科学用药规律与安全、有效、合理用药;从而帮助药物的实验、研究、生产和临床使用;在开发新药、人类保健方面有着重要作用[1]。

　　喹诺酮类化合物是一种抗菌剂，主要用于各种细菌引起的细菌性疾病，其作用原理是直接作用于细菌的核、抑制细菌的DNA旋转酶、控制细菌DNA的复制、破坏细菌的代谢增殖，因此它们具有杀菌作用，最初，喹诺酮类化合物只用于人体和动物的尿路感染中[2,3]。但是，特别是第二代喹诺酮类化合物发明以后，到现在发展到第四代产品，很多作为兽药使用，对革兰氏阳性和阴性病毒源体有很好的杀菌作用[4]。因喹诺酮类具有抗菌谱广、抗菌作用强、生物利用度高、毒副作用小、组织分布广等特点，已被世界各国广泛用于临床、畜禽和鱼类疾病的防治。近年来，滥用抗生素现象十分严重，产生了不良后果：使人体不良反应增加;抗病作用越来越小，细菌耐药性增强，不能完全消灭“新生代”细菌同时杀死人体内有益菌群，危及人体健康。喹诺酮类药物动力学研究有于确定正确休药期，提高动物肉品质，保障肉食品安全,促进动物源性食品出口等;同时对改进药物剂型、减少环境因素对药物的影响并有利于环境保护[5]。到目前为止，国内外学者研究了各种条件下多种喹诺酮类药物在体内的动力学规律，如水产类[6-10]、家禽类[11-12]、临床研究[13-14]和其它动物如老鼠等[15]。

　　查阅相关文献发现，到目前为止还没有鸡血浆中的喹诺酮类药物测定的文献报道，特别是同时测定丹诺沙星(danofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、诺美沙星(lomefloxacin)、噁喹酸(Oxolinic acid)和氟甲喹(Flumequine)。本文以高效液相色谱法同时对生物体内丹诺沙星、加替沙星、诺美沙星、噁喹酸和氟甲喹等五种喹诺酮类药物进行测定，该方法前处理技术简单、干扰小，方法精密度高，选择性好。

　　表 1 五种喹诺酮类药物的分子式和结构式

　　Table 1 Molecular and structural formula of five quinolones

　　Materia medica

　　Molecular formula

　　Structural formula

　　Lomefloxacin

　　(LOM)

　　C17H19F2N3O3

　　Oxolinic acid

　　(OXA)

　　C16H16F1N3O3

　　Flumequine

　　(FLU)

　　C14H12FNO3

　　Gatifloxacin

　　(GAT)

　　C19H16FN2O4

　　Danofloxacin

　　(DAN)

　　C20H10FN3O3

　　2. 实验部分

　　2.1 动物及分组

　　54日龄健康AA肉仔鸡4只，雌性，平均体重为1.5Kg(扬州大学动物科学与技术学院提供)。试验鸡随机笼养，给药前称重、编号。试验前预饲1周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料， 自由饮水。内服给药前禁饲12 h，给药后禁饲4 h，停料不停水。

　　2.2 仪器、药品与试剂

　　日本岛津LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10AVP紫外检测器，岛津CTO-10AVP柱温箱，DGU-12脱气器，SCL-10 AVP系统控制器，Class-VP色谱工作站。AB-2型旋涡混合器(江苏医疗仪器厂)，pHS-3型pH计(上海雷磁仪器厂)，321 型超声波清洗机，TGL 216C 高速台式离心机。实验用水为二次去离子水，甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)，磷酸二氢钠(分析纯)，其他试剂均为分析纯。

　　2.3 标准溶液的配制

　　精确称取5种标准品，分别溶于甲醇中并稀释至1.0 mg/mL，所有溶液保存在-20°C条件下。

　　2.4 给药及采样

　　每只试验鸡喂食一粒各含20mg标准品的胶囊。鸡翼下左侧静脉采集血液样品，药前采集静脉血作空白对照。给药后分别于0、60min、90 min、120 min、150 min、210 min、270 min、5h、6h、8h、10h、12h各采血1 次，每次采血量2.0mL ，肝素钠抗凝，以12000 r/min的离心速度离心10 min，分离血浆，-20°C冰箱保存备用。

　　2.5 血浆样品前处理

　　血浆样品室温下自然解冻、摇匀。外加标准溶液的血浆对照品制备方法是：准确吸取100mL标准溶液加入到900mL空白血样中制备成新的标准混合液，并加入甲醇至2.0 mL。混合液振荡1 min，在12000转/min的离心机上离心分离5 min，移取1.0mL上层清液，取60mL注入高效液相色谱仪中进行色谱分析，以峰面积采用外标法进行定量分析。空白鸡血样和未知血样按上述方法和步骤同样进行处理。

　　2.6　反相高效液相色谱分析方法的建立

　　2.6.1 液相色谱条件

　　色谱柱：VP-ODS柱(150 mm ´ 4.6 mm, 5.0 mm，日本岛津 );流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液(体积比为1:1，缓冲溶液pH=6.8);检测器：紫外-可见光检测器，检测波长：265 nm;柱度：25◦C;流速：1 mL/min。

　　2.6.2 标准曲线和线性范围

　　在9支微量离心管(1.5mL ) 中准确加入0.90mL 空白血浆, 每支离心管中依次加入不同量的标准液,加入甲醇使标准品浓度为：0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 25.0, 50.0μg/mL。旋涡混合2 min, 12000 r/min离心分离10 min, 直接吸取上清液60μL进样作HPLC分析。将五种喹诺酮类药物的色谱峰面积 (y) 与药物浓度(x) 作直线回归, 求得标准曲线的回归方程和相关系数。

　　2.6.3 精密度测定

　　配制三种不同浓度的含五种类喹诺酮类药物(0.50，5.0和25.0 mg/mL)血浆样品溶液，在同一天连续进行5次进样计算相对误差来评价日内精密度;每天对上述浓度进行测定，每个浓度平行测定5次，连续测定5天计算相对误差来评价日间精度度。

　　2.6.4 稳定性测定

　　用低、中、 高三种浓度的含五种类喹诺酮类药物(0.50，5.0和25.0 mg/mL)血浆样品溶液来测定其在鸡血中的稳定性。将上述溶液分成两份，一份在室温下放置1天后进行测定;另一份溶液分别冷冻(-20°C)放置、冷冻后融化1次再在冷冻放置，冷冻后再融化再冷冻放置，共融化三次，两周后进行测定。

　　3 结果与讨论

　　3.1 五种喹诺酮类药物的选择性

　　图1给出了在选定实验的色谱条件下, 在波长265nm处得到的五种喹诺酮类药物的色谱图。由图可测得洛美沙星、噁喹酸、氟甲喹、加替沙星、和单诺沙星的保留时间分别为为2.51, 2.93, 3.79, 4.95 和5.86min，并且五种喹诺酮类药物色谱峰峰形较好, 且均为基线分离峰。空白血浆提取液在上述保留时间对五种喹诺酮类药物均无干扰。

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