【摘要】本实验通过单因素试验和正交试验探讨了葛根异黄酮的最佳浸取工艺，并对大孔树脂对葛根异黄酮纯化进行了详细研究。试验结果表明：浸提时，在温度为70℃的条件下，用8倍于(v/w)葛根量浓度为50%的乙醇，浸提2.5h，葛根异黄酮浸取率最高;对六种商品化大孔树脂吸附纯化葛根异黄酮的性能进行对比筛选，发现AB-8树脂最适合葛根异黄酮的纯化。实验结果表明，洗脱剂乙醇浓度为70%(v/v)，工作液流速为2BV/h，浸提浓缩液pH值为5时，采用AB-8大孔吸附树脂串联柱对葛根异黄酮进行纯化，其效果最优，产品的收率和纯度都较高。

　　【关健词】葛根，异黄酮，提取，大孔吸附树脂，纯化

　　葛根(Radix Pueraria)，是豆科植物葛(Puerar Lobatel (willd).Ohwi)的块根，含有葛根素、葛根木糖苷、大豆甙、大豆甙元等多种异黄酮类物质，干物质含量为50mg/100g[15]，其味甘、辛、性平，既是中药材又是营养丰富的食用原料，且《神农本草经》中列为中品，并为中国药典所收载。葛根中异黄酮是一种毒性极低、安全的药物。它可以解肌退热，生津止渴、降低心肌耗氧量、增加冠脉脑血管流量、缓减心绞痛、抗心肌缺血、抗心律失常、抗氧化、降低血压、降低血糖、调节血脂、解毒、增强机体免疫力等多种药理作用[2]。葛根的粗提物中含多种成分，如入药时，必须对粗提物进行选择分离，提高异黄酮的纯度。选择性分离的一种有效方法是利用大孔树脂吸附，大孔树脂具有吸附性能好、吸附效率高、再生简单、解吸条件温和、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点[11]。

　　我国湖南、广西、江西及西南地区均有丰富的野生葛根资源，同时市场对葛根黄酮需求量越来越大，但我国科技投入不足，葛根异黄酮制取技术相对落后、生产效率低、耗能大、杂质含量高、产品缺乏市场竞争力，因此，本文对葛根异黄酮提取及对粗提物进行纯化提高葛根异黄酮的纯度，均有着重要的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要仪器

　　层析柱(上海沪西分析仪器厂);SP-2100型紫外-可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;KQ-1500型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司;电热数码恒温水浴锅(金坛市华仪器有限公司);RE—86旋转蒸发器(上海本波仪器有限公司);LD5—2A离心机(北京医用离心机厂)、电子称、烘干箱等。

　　1.2 材料与试剂

　　葛根(野生，重庆合川)、葛根素(中国药品生物制品检定所)、AB—8大孔树脂(南开大学化工产品)、pH试纸、乙醇、NaOH、HCl等均为国产分析纯。

　　1.3 试验方法

　　1.3.1 葛根异黄酮浸提及纯化工艺流程

　　葛根→粉碎→乙醇浸提→过滤→浓缩→95%乙醇沉降水溶性杂质→浓缩→大孔树脂吸附→蒸馏水洗脱→乙醇洗脱→收集洗脱液

　　1.3.2 葛根异黄酮含量的测定

　　1.3.2.1 标准曲线的绘制

　　以葛根素为标准物，用紫外分光光度法测定。准确称取葛根素标准品5mg，置于25ml容瓶中加浓度为95%的乙醇溶解并稀释刻度，摇匀，从中分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml溶液置于6个10ml的试管中，各加乙醇浓度为95%的乙醇1ml，用蒸馏水将体积定至10ml，摇匀，以第一管为对照，在250nm处测吸光值(A)与葛根素含量(C)之间的关系作为异黄酮测定标准曲线方程，该方程为A = 83.4C-0.032，γ= 0.9999，得标准曲线(见图1)：

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　　图1 葛根素标准品吸光度标准曲线

　　图1 葛根异黄酮测定的标准曲线

　　1.3.2.2 浸提物中总异黄酮含量的测定

　　将浸提溶液过滤，滤液混匀，准确吸取1ml置入100ml容量瓶中，加入95%的乙醇至刻度，摇匀，在250nm波长下测定其吸光度，以同样乙醇作空白，并根据标准曲线方程计算葛根中异黄酮的含量。

　　1.3.3 AB—8型大孔树脂预处理[17]

　　将AB—8树脂先用乙醇浸泡24h充分溶胀，湿法装柱。然后用95%乙醇洗至洗出液加适量水无白色混浊现象，再用蒸馏水洗尽醇，最后转入酸碱处理：用4BV的5%HCl溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡3h，而后用蒸馏水以同样的流速洗至流出水pH值为中性;再用4BV的5%NaOH溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡3h，而后用蒸馏水以同样的速度洗至流出水pH值呈中性。

　　1.3.4 葛根异黄酮的纯化

　　将浸提的异黄酮浓缩液上柱，控制流速3~5ml/min，当溶液全部吸附后，用蒸馏水洗脱至流出液为无色，然后用乙醇进行洗脱至流出液为无色，将洗脱液收集在容器中，测其吸光度，并计算出异黄酮的含量。

　　2 结果与分析

　　2.1 葛根异黄酮提取的单因素试验

　　2.1.1 溶剂浓度对葛根异黄酮浸提效果的影响

　　分别用浓度不同的乙醇溶液对葛根浸提，可以发现随乙醇浓度的增加，浸出物的颜色由棕黑色逐渐变为黄褐色。结果(见表1)表明：乙醇浓度为50%时，葛根异黄酮的含量最高，浸提效果较好。

　　表1 乙醇浓度对葛根异黄酮浸提效果的影响

　　乙 醇 浓 度 (%)

　　40

　　50

　　60

　　70

　　80

　　吸 光 度 (A)

　　0.606

　　0.642

　　0.588

　　0.395

　　0.332

　　异黄酮含量(mg·ml-1)

　　1.53

　　1.62

　　1.41

　　1.02

　　0.870

　　注：其他提取条件：固液比1﹕8，温度60℃，浸提3h

　　2.1.2 固液比对葛根异黄酮浸提效果的影响

　　在溶剂浓度为最佳条件时，以能浸没样品的最少溶剂量为基础，确定最低限度固液比为1﹕6，改变固液比的试验结果(见表2)表明：当固液比为1﹕8时，浸出物异黄酮含量达最高，随着固液比减小，含量略降。

　　表2 固液比对葛根异黄酮浸提效果的影响

　　固 液 比

　　1﹕6

　　1﹕8

　　1﹕10

　　1﹕12

　　1﹕14

　　吸 光 度 (A)

　　0.671

　　0.685

　　0.669

　　0.618

　　0.396

　　异黄酮含量(mg·ml-1)

　　1.69

　　1.72

　　1.68

　　1.56

　　1.03

　　注：其他提取条件：乙醇浓度50%，温度60℃，浸提3h

　　2.1.3 提取时间对葛根异黄酮浸提效果的影响

　　在确定提取溶剂浓度、固液比之后，考察提取时间对浸提效果的影响。结果(见表3)表明：浸提2h后基本达平衡。原因可能来自两个方面，一是生物活性成分异黄酮葛根素、大豆甙、大豆元等存在于外部的木栓层下面的外部薄层组织中，二是磨碎后的葛根粉容易被溶剂浸透，2h后，活性物质在固相和液相的浓度就达到了平衡。

　　表3 提取时间对葛根异黄酮浸提效果的影响

　　浸 提 时 间 (min)

　　90

　　120

　　150

　　180

　　210

　　吸 光 度 (A)

　　0.655

　　0.772

　　0.766

　　0.763

　　0.754

　　异黄酮含量(mg·ml-1)

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