摘要：本文通过研究微量营养素的不同添加量对玉米酵母流加培养过程中糖液流加速率，溶氧量，酵母细胞浓度，酵母细胞生长率的变化，得出：微量营养素的添加量为：CaCl2 28.8mg·L-1，FeSO4 14.4 mg·L-1，盐酸硫氨 4.8mg·L-1，生物素0.12mg·L-1，D-泛酸钙6.4mg·L-1，肌醇120mg·L-1，玉米酵母细胞的产率提高了80.9%。

关键词：玉米酵母，微量营养素，流加培养

The Study on Dryness of Maize Yeast

LI Zhu-sheng1, Zhang Xin-wei1, SONG Na1, NIU Fang-fang 2

(1. Zhengzhou Technical College 2.ZhengzhouJincheng Milling EngineeringTechnology Limited Company )

Abstract: By measuring the rate of glucose fed-batch, dissolved oxygen, the concentration of yeast and growth rate, the technological process of fed-batch culture of yeast was preliminarily established using maize as carbon source. Accoding to the fermentor experiment, the yield of yeast improved by 80.9% through adding the micronutrients. The proper amount of the six kinds of micronutrients were as follows: thiamine hydrochloride 4.8mg·L-1; biotin 0.12mg·L-1; calcium pantothenate 6.4mg·L-1; myo-inositol 120mg·L-1; Cacl2 28.8mg·L-1; FeSO4 14.4mg·L-1.

,

Key words: Maize yeast; Micronutrients; Fed-batch culture


微量元素和维生素（统称为微量营养素）对酵母菌的生长有着至关重要的作用。微生物的生长繁殖和产生代谢产物都需要无机盐和微量元素，它们在机体中的生理功能主要是作为细胞结构物质的组成部分、参与酶的组成并调节酶的活性、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等，这些物质一般在较低浓度时对细胞的生长和产物合成有促进作用，而在高浓度时常表现出显著的抑制作用。但不同的微生物对无机盐和微量元素的需求程度是不同的，同一种微生物的不同生长阶段对这些物质的最适需求量也不同[1]。因此确定微量营养素的最佳添加量可显著提高流加培养酵母的产率。本文分别选择不添加营养元素、添加1倍营养元素和3倍营养元素进行对比试验，研究微量营养素对玉米酵母流加培养的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

玉米粉:脱皮脱胚玉米粉（过60目筛），郑州市伊河路市场购买；

酵母：梅山酵母，中国番禺梅山-马利酵母有限公司；

D-泛酸钙（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；肌醇（生化试剂）：天津市科密欧化学试剂开发中心；硫酸亚铁（分析纯）：天津市科密欧化学试剂开发中心；无水氯化钙（分析纯）：宿州化学试剂厂；盐酸硫胺（生化试剂）：中国惠兴生化试剂有限公司；生物素（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2设备

BMR－A10USIP型发酵罐：上海傲中生物工程设备有限公司

1.3实验方法

1.3.1流加培养流程：

灭菌→准备→接种→适应期→积累期→成熟期

1.3.2微量营养素的添加量：杨兆明[2]的试验中已经初步确定在酵母摇瓶培养过程中各微量营养素在玉米糖液中的添加量为：CaCl2 28.8mg·L-1，FeSO4 14.4 mg·L-1，盐酸硫氨 4.8mg·L-1，生物素0.12mg·L-1，D-泛酸钙6.4mg·L-1，肌醇120mg·L-1。在发酵液中，三倍、单倍和不添加各种微量营养素进行流加培养。

1.3.3产品中酵母活细胞率测定：

立即吸取活化好的细胞悬液0.1mL，加入9.9mL次甲基蓝染色液于20℃染色10min，显微技术。采用血球计数法，选取四个对角上的方格以及最中间的一个方格计数。每个样品重复3次，取平均值进行计算。在计数中无色透明者为酵母活细胞，被染上蓝色者为死亡酵母细胞。

1.3.4 酵母菌细胞浓度测定[3]

制作酵母菌溶液细胞浓度标准曲线：将干酵母在40℃通风干燥5h， 按表1配成不同浓度，用分光光度计测定吸光值，利用Excel软件作出标准曲线，求出回归方程。


表1 不同水平的酵母菌细胞浓度

水平

1

2

3

4

5

6

7

细胞浓度/g•L-1

0.2

0.4

0.6

0.8

1

2

3


酵母菌细胞浓度测定：取酵母菌溶液2.5mL或1mL，3000r·min-1离心20min，同样条件下用蒸馏水洗涤酵母菌沉淀两次，准确量取5mL蒸馏水溶解酵母菌，以蒸馏水为参比液，在540nm测定吸光值，通过标准曲线计算得细胞浓度。

2.结果与讨论

2.1微量营养素不同添加量对玉米酵母流加培养的糖液流加速率影响



图1  不同微量营养素添加量的流加培养的糖液流加速率变化


微量营养素的不同添加量对玉米酵母流加培养过程中糖液流加速率影响由图1可知：1倍添加微量营养素的糖液流加速率明显高于其它两种，微量元素是酵母生长和合成各种酶的重要物质，其对酵母的生长和底物的利用有激活作用，而未添加微量元素的糖液流加速率一直保持在较低的水平，说明微量元素的缺乏会严重抑制酵母菌的生长。而3倍添加微量元素的糖液流加速率在第2~18h一直保持在40mL·h-1，过多的微量元素并没有起到进一步促进酵母生长的作用，反而有较大的抑制作用。

2.2微量营养素不同添加量对玉米酵母流加培养过程中溶氧量影响



图2  不同微量营养素添加量的流加培养过程中溶氧量变化


微量营养素不同添加量对玉米酵母流加培养过程中溶氧量影响是由图2可知：前4h随着酵母细胞的生长，溶氧量急剧降低，第4h溶氧量即降到50%以下，1倍添加的溶氧量更是降低到30%左右。通过加大转速及通氧量，4~12h基本保持在50%左右。但随着发酵的继续进行，1倍添加微量元素的流加培养在第15h就降到5.4%，之后溶氧一直较低，说明酵母生长较快，通入的氧气不足以满足酵母细胞生长的需要。而3倍添加微量元素的流加培养由于其较大的抑制作用，造成细胞生长缓慢，细胞数量较低，其在发酵的后期溶氧量基本保持在30%左右。不添加微量元素的流加培养由于其细胞数量最少，其后期的溶氧量在40%左右。

2.3微量营养素不同添加量对玉米酵母流加培养中细胞浓度的影响



图3微量营养素不同添加量的流加培养中细胞浓度的变化


微量营养素不同添加量对玉米酵母流加培养中细胞浓度的影响由图3可知，添加微量营养素对酵母产量有较大的促进作用，1倍、3倍添加量的细胞浓度要显著高于未添加的，未添加微量营养素最终的酵母细胞浓度只有26.776g·L-1，单倍添加量达到了38.103g·L-1，高出42.3%。三倍添加微量营养素没有更大提高酵母的产量，反而整个过程细胞浓度都较低，最大为33.341g·L-1，其产量高于未添加的，但低于1倍添加的，说明适量微量营养素对酵母产量的增加起到了至关重要的作用。

2.4微量营养素不同添加量对玉米酵母流加培养过程中细胞生长速率的影响