【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 慢性乙型肝炎；外周血；Notch受体
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正文：
[摘 要]目的 分析慢性乙肝患者外周血中Notch受体的表达，研究Notch信号在慢性乙肝患者发病机制和治疗中的作用。方法 收集保定市第二中心医院2012年11月至2013年12月42例慢性乙型肝炎患者为实验组， 根据转氨酶的高低分为转氨酶大于100U∕ml组和转氨酶40-100U∕ml，另外收集42例正常人作为对照组。 采集实验组和对照组的新鲜空腹抗凝血，分离单个核细胞，提取RNA,反转录为cDNA，应用实时定量PCR的方法检测Notch受体；并收集血清，用ELISA的方法检测Notch受体。结果 两组实验组的Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的两组实验组的与对照组相比，mRNA表达水平明显升高，具有显著性差异（P＜0.05）；转氨酶大于100U∕ml组中的表达水平升高更明显（P＜0.05）；两组实验组Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的血清表达水平与对照组相比均有明显增加（P＜0.05），转氨酶大于100U∕ml组中的表达量增加更明显（P＜0.05）。
[关键词] 慢性乙型肝炎；外周血；Notch受体
The expression of Notch Acceptor in peripheral blood of patients with the Chronnic hepatitis B
 
通讯作者：崔玉秀，女，毕业于河北医科大学免疫学，硕士，主要从事感染免疫和肿瘤免疫的研究。
第一作者：赵宏艳，本科，主管检验师，重要从事医学检验工作。
指导教师：曾瑞红，女，博士，教授，主要从事感染和肿瘤免疫的研究。
 [Abstract] Objective To analysis Notch receptors expression, of patients with chronic hepatitis B in peripheral blood, we studied the role of Notch signaling in the pathogenesis of chronic hepatitis B patients and therapy. Method  We collected the samples of Bao Ding Second Central Hospital from December 2012 to October 2013, 42 patients with chronic hepatitis B were divided into two groups，one group with the more than 100U∕ml transaminase，and another group with 40-100U∕ml transaminase. 42 healty persons served as the normal control group. Anticoagulant fresh blood on an empty stomach was collected from experimental groups and control group, RNA of mononulear cells was extracted, and reverse transcribed into cDNA. The relative mRNA expression of Notch receptors; Sera of experimental groups and control group was collected, Notch receptors were detected with ELISA methed.
Results: The Relative mRNA expression of Notch1, Notch2, Notch3, and Notch4 of the two experimental groups were significantly higher than that in control group(P＜0.05).The relative mRNA levels of Notch receptors in the group with the more than 100U∕ml transaminase was higher than that those in the group with 40-100U∕ml transaminase(P＜0.05). Compared with those of the normal control group, the serum levels of Notch1, Notch2, Notch3 and Notch4 of the two experimental groups were significantly increased, the experimental group with the more than 100U∕ml transaminase was significantly increased than that those of the group with 40-100U∕ml transaminase(P＜0.05).
Key Words: chronic hepatitis B; peripheral blood; Notch receptors
乙型肝炎病毒（HBV）是世界上久治不愈的病原体之一，慢性乙型病毒性肝炎是指人体感染HBV后，引起的肝脏慢性炎症坏死性疾病，HBV属于嗜肝DNA病毒。肝脏疾病发展过程中HBV和宿主之间出现了复杂的相互作用，免疫应答介导了肝脏的炎症性疾病。
Notch基因于1917年由基因学家Thomas Hunt Morgan及其同事研在果蝇的翅膀边缘上的首次发现Notch【1】。结果发现这些有Notch表型的翅膀是由于缺少一种Drosophila Notch基因造成的，该基因在80年代中期被克隆出来【2】，并因此而得名。Notch信号途径由Notch受体、Notch配体和CSL（一类DNA结合蛋白）、其他效应物、Notch的调节分子组成。在哺乳动物中4个Notch受体（Notch1-4）和5个配体（Jagged1和2，Delta1,3和4）已经被发现[3,4]。近年来越来越多的研究发现，Notch信号与细胞的命运决定和免疫系统的发育有密切关系。最近，大量的研究表明; 在对病毒等病原微生物的应答过程中，Notch信号对巨噬细胞、树突状细胞、T和B淋巴细胞等外周免疫细胞的激活和分化方向起着关键的调节作用[5]。本研究旨在考察Notch受体在慢性乙型肝炎病毒患者外周血中的表达情况。
1材料与方法
1.1收集病例
1.1.1收集2012年11月至2013年12月我院慢性乙肝患者42例。根据转氨酶的高低，将实验组分为转氨酶大于100U∕ml组和转氨酶40-100U∕ml，其中男性30例，女性12例。年龄在26岁-76岁之间，平均年龄56.7岁。另外42例同期收集正常人做为正常对照组，年龄在28岁-72岁之间，平均年龄57.9岁。实验组和对照组年龄性别无统计学差异。
1.1.2、病例选择标准
入组患者仅为为慢性乙型肝炎，乙型肝炎病毒DNA定量阳性。排除梅毒螺旋体特异性抗体阳性、HIV感染、自身免疫性肝病以及其他感染的情况（如感冒等），因为这些感染情况可能会导致测定结果的升高。
1.2方法
1.2.1血液标本采集
采集两组实验组患者及正常对照组健康人空腹静脉血8ml。其中6ml分为3管，每管2ml，用EDTA 抗凝，及时分离单个核细胞，分离好的单个核细胞放-20℃低温冰箱保存，编号记录。以便集中提取RNA。例外2ml血液标本不抗凝，待其自然析出血清后离心1500rpm，15min，收集血清置于-80℃低温冰箱保存。
1.2.2提取单个核细胞并提取RNA
取收集的实验组和对照组新鲜抗凝血2ml，与Hank’s液1:1混匀后，沿管壁小心地加入2ml的人淋巴细胞分离液的液面上，1500rpm，15min，离心管从上往下分为四层，第一层是血浆和组织液，第二层是环状乳白色的单个核细胞，第三层是透明的分离液面，tr6uj  第四层是红细胞。小心的收集第二层细胞，沉淀经反复洗涤2次可得得到的细胞加入Triol试剂1ml每管，静置5min，充分裂解细胞后吹吸混匀后放-80℃低温冰箱保存，以备提取RNA。收集完实验组和对照组的血后，按说明书采取标准的提取RNA 的方法提取总RNA，反转录制备模板cDNA，用实时定量PCR的方法检测Notch1、Notch2、Notch3、Notch4。
设计并合成Real-Time PCR引物
Notch1 Forward Primer ：5'-GTGTTTATGGGCCTTGGGAGT-3'          Notch1 Reverse Primer: 5'-GCGAGTCCACAATGCACATTGG-3';
Notch2 Forward Primer: 5'-TGGAGGTAAATGAATGCCAGAGC-3'
Notch2 Reverse Prime：5'-TGTAGCGATTGATGCCGTCC-3'
Notch3 Forward Primer：5'-CGCTTTCTGCTTCTCATTgTC-3'            Notch3 Reverse Primer： 5'-CAAGGCTGGCTACTTGGTACA-3';
Notch4 Forward Primer： 5'- CACCTCCTGCCATAACACCTTG-3'            Notch4 Reverse Primer： 5'-CAAGGCTGGCTACTTGGTACA-3'
1.2.3 ELISA的方法检测Notch1-4受体的含量
从-80℃低温冰箱取出实验组和对照组的血清，按照受体Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的ELISA检测试剂盒的说明书操作。肝癌患者血清学检测, 采用酶联免疫吸附试验( ELISA) 法, 试剂盒购自厦门新创科技有限公司;血清Notch1-4受体测定均采用ELISA 法; 所有检测项目均严格按照试剂盒使用说明书操作。采用标准的EIISA程序。在相应孔中加入待测样品、标准品和空白对照各100ul/孔，待测样品为实验组患者的血清和正常对照组的血清都要加入。采用双复孔的办法（其中血清浓度要采用梯度稀释的办法，提前选择最佳反应浓度）。ELISA滴度表示为最后稀释度的对数，OD值≥0.15并且至少是阴性对照的两倍。

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