摘要:目的 提取三七蛋白，并研究其对小鼠巨噬细胞的免疫调节活性。方法 采用中性盐缓冲溶液提取三七蛋白，采用lowry法测定蛋白含量并利用SDS-PAGE电泳法测定三七蛋白的亚基分子量分布。以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型研究三七蛋白对细胞吞噬能力的影响，刺激产生NO含量，释放IL-6、TNF-α来考察其对巨噬细胞免疫活性的影响。结果 用lowry法测定三七蛋白的蛋白含量为1.95 mg/mL，三七蛋白的亚基分子量从18kD 到 63kD。三七蛋白可通过增强巨噬细胞吞噬能力，释放免疫因子等方面增强巨噬细胞免疫活性。

　　关键词:三七蛋白;巨噬细胞;免疫调节

　　三七为五加科植物三七(Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen)的干燥根及根茎。三七被人们称为“金不换”，具有止血、散瘀、消肿、止痛等功效[1]。三七中的化学成分复杂，主要包括皂苷类、挥发油类、氨基酸类、黄酮类、糖类、蛋白质及多肽、无机盐类等[2-6]。现代药理学研究表明，三七具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、降血糖等活性，并对其他药理活性起着协同调节作用[7- 9]。三七中的皂苷成分被认为是三七的主要活性成分，但是近年来的研究表明，三七多糖等大分子也具有明显的生物活性[10-12]，而这些大分子往往被人们所忽视。本研究针对三七当中的大分子物质蛋白质进行提取和性质检测，并以小鼠巨噬细胞为研究对象，对三七蛋白体外的免疫调剂活性进行初步的探索研究，为把三七蛋白开发成保健食品的原料提供科学的依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂和仪器

　　DMEM培养基，购于Gibco公司，MTT，购于Thiazoly公司，DMSO，天津天泰精细化学品有限公司，TNF-α酶联免疫测定试剂盒、IL-6酶联免疫测定试剂盒，购自上海朗顿生物科技有限公司，脂多糖(LPS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS) 均购于 Sigma 公司。Infinite 200 Pro型酶联免疫检测仪，购自瑞士TECAN公司，3111型CO2培养箱购自Thermo Forma公司。

　　1.2细胞株

　　小鼠巨噬细胞样细胞株 RAW264.7(ATCCTIB-71)，购买于购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

　　1.3实验方法

　　1.3.1三七蛋白的提取

　　称取粉碎后的三七粉500g，加入浓度为0.01mol/L，pH9.0的Tris-HCl缓冲溶液5000mL，4℃浸提，浸提24h后，用绢布过滤浸提液，滤渣加入5000mL Tris-HCl缓冲溶液(0.01mol/L，pH9.0)4℃浸提24h，用两层绢布过滤浸提液，合并浸提液，4000r/min离心20min，收集上清。用中空纤维膜过滤系统超滤(0.45um)和微滤(MW10000)浸提液，收集大分子滤液，向滤液中缓慢加入(NH4)2SO4，使饱和度达到75%，4℃沉淀12h后，4000r/min离心20min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解，透析(MW8000)，冻干，即得三七总蛋白(NGP)。

　　1.3.2三七蛋白的含量测定

　　采用lowry法测定蛋白含量，按照试剂盒使用说明书测定三七蛋白的含量。

　　1.3.3三七蛋白分子量分布测定

　　采用SDS-PAGE电泳测定三七蛋白的亚基分子量分布。

　　1.3.4细胞吞噬能力实验

　　取对数生长期的RAW264.7细胞制成细胞悬液，细胞密度为6×105个/mL接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养6h。待细胞贴壁后加入不同浓度药物每孔20μL，补加80μL培养基，每个浓度设6个复孔，空白组以同体积无菌PBS代替，阳性对照组加入同体积20μg/mL LPS，培养24h。用中性红吞噬实验检测细胞吞噬能力，每孔加入100μL 0.075%的中性红溶液，继续孵育1h后，吸出孔内培养基，用PBS吸去残留中性红，加入150μL90%乙酸乙醇裂解液，充分混匀，测定每孔在550nm处的光度值(OD)。

　　1.3.5 NO含量检测

　　取对数生长期的RAW264.7细胞制成细胞悬液，细胞密度为2×106个/mL接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养6h。待细胞贴壁后加入不同浓度药物每孔20μL，补加80μL培养基，每个浓度设6个复孔，空白组以同体积无菌PBS代替，阳性对照组加入同体积20μg/mL LPS，培养24h。采用Griess法测定NO含量：标准孔加入浓度为100μmol/L的亚硝酸0、10、20、30、40、50μL，加蒸馏水补足50μL，样品孔分别加入各组培养基50μL，之后再加入50μL Griess试剂，振摇10min，测定各孔于540nm处的光度值(OD)，根据标准孔绘制出亚硝酸浓度与光度值的标准曲线，并计算个样品孔NO浓度。

　　1.3.6 IL-6、TNF-α含量检测

　　细胞培养液中IL-6的测定参照酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒说明，将各组细胞上清液在10000 r/min、4℃下离心10min，吸取上清20μL进行酶联免疫吸附反应，在450nm测定吸光度值(OD值)，计算IL-6含量。

　　细胞培养液中TNF-α的测定参照酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒说明，将各组细胞上清液在10000 r/min、4℃下离心10min，吸取上清20μL进行酶联免疫吸附反应，在450nm测定吸光度值(OD值)，计算TNF-α含量。

　　1.3.7 数据处理

　　所有数据均以均值±标准差表示。t 检验采用SPSS11.5 统计软件包完成，以 P<0.05 表示差异显著;P<0.01 表示差异极其显著。

　　2 结果与讨论

　　2.1三七蛋白的蛋白含量和分子量分布

　　采用lowry法测定三七蛋白的蛋白含量为1.95 mg/mL，三七蛋白的亚基分子量分布如图1所示，三七蛋白的亚基分子量从18kD 到 63kD，其中分子量为28kDa的和25kDa的蛋白含量最高。

　　图1 三七蛋白SDS-PAGE 图

　　2.2三七蛋白对细胞吞噬能力的影响

　　三七蛋白对RAW264.7细胞吞噬能力的影响如图2所示，由图可知，细胞吞噬能力与样品浓度呈量效关系。结果表明三七蛋白具有增强细胞吞噬能力的作用(p<0.01)。

　　图2 三七蛋白对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

　　2.3 三七蛋白对RAW264.7细胞释放NO的影响

　　Griess法测定NO含量所得标准曲线为y=0.0033x+0.0409，R2=0.9997，由标准曲线得各组NO浓度如图3所示。由图可知空白组细胞产生NO最少，为26.75±1.22μmol/L，阳性对照组细胞产生NO最多，为28.47±1.17 μmol/L，实验组细胞产生NO含量随三七蛋白浓度的增加而增加。三七蛋白不同浓度与空白组相比均有显著性(p<0.01)，且各实验组NO浓度均低于阳性对照组。

　　图3 三七蛋白对RAW264.7细胞释放NO的影响

　　2.4 三七蛋白对RAW264.7细胞分泌IL-6、TNF-α的影响

　　三七蛋白对RAW264.7细胞分泌IL-6的影响如图4所示。

　　图4 三七蛋白对RAW264.7细胞分泌IL-6和TNF-α的影响

　　如图所示，各组IL-6浓度均高于空白组。三七蛋白对RAW264.7细胞分泌IL-6有促进作用，和空白组对比具有显著性意义(p<0.01)。

　　三七蛋白各浓度均能促进分泌TNF-α(p<0.01)，浓度为200μg/mL时，TNF-α含量最高为3.54±0.10ng/mL，是空白组的9.8倍。各组TNF-α浓度均小于阳性对照组，说明三七蛋白促进RAW264.7细胞分泌TNF-α的作用温和。

　　3 结论

　　巨噬细胞是机体非特异性免疫的关键细胞，病原微生物入侵机体时首先被巨噬细胞识别、吞噬，巨噬细胞的吞噬能力影响免疫应答强弱。本研究中用不同浓度的三七蛋白培养RAW 264.7细胞，研究细胞吞噬能力、NO分泌能力、IL-6和TNF-α释放能力。结果显示三七蛋白组细胞吞噬中性红增多，说明三七蛋白能增强细胞吞噬能力。本研究表明不同浓度的三七蛋白作用于RAW 264.7细胞，细NO分泌增多，说明三七蛋白可通过上调限制酶iNOS的表达来促进NO分泌，增强巨噬细胞杀死病原微生物的能力。

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