【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 PLL-PEG-PEI；体外基因转染；转染效率；多发性硬化
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正文：

1.7 统计学方法
数据拟采用SPSS16.0软件进行统计处理，计量资料采用表示，计数资料采用百分率表示，分别采用t检验、方差分析比较均值间的差异，计数资料则采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
2.1 纳米粒与质粒DNA的结合能力
当N/P≥0.5时，PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP在凝胶上的泳动已被完全阻滞。但N/P≥5时，PEI 25kD与pAAV-EGFP才完全结合（图1）。
2.2 细胞毒性检测结果
以PEI 25kD为对照，在不同的N/P时对PBMC细胞进行了MTT检测，纳米材料载体都有一定的细胞毒性。从图2可以得出，在PBMC细胞中，在N/P=15时PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP是73%，比PEI 25kD/pAAV-EGFP（51%）的细胞存活率要高( P<0.05)；N/P<15时，PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI 25kD/pAAV-EGFP的存活率相当，只是在N/P﹥15时PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的细胞存活率才比PEI 25kD/pAAV-EGFP 低( P<0.05)。
2.3  细胞转染效果
2.3.1 倒置荧光显微镜观测细胞转染效果  　为了直观检测各种载体的转染效果，载体与pAAV-EGFP复合后，在两种细胞中进行转染，然后分别用倒置荧光显微镜观测。在PBMC细胞中，在不同的N/P比时PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP复合物比PEI 25kD/pAAV-EGFP的绿色荧光多。荧光照片如图3所示，N/P=15时PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP表达出最大的荧光。
2.3.2 流式细胞仪检测细胞转染效果  为进一步明确细胞中的转染效率，本实验还利用流式细胞仪检测了N/P=15时PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI 25kD/pAAV-EGFP在PBMC细胞的转染效率，结果发现在PBMC细胞中PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的转染效率最好，为20.3％；PEI 25kD/pAAV-EGFP 为11.9％，结果比较差异有统计学意义（P<0.05，图4）。
 
图1 PLL-PEI-PEG结合pAAV-EGFP的能力
 
图2 不同N/P比时基因复合物在PBMC细胞中的促细胞凋亡作用
 
PLL-PEI-PEG                        PEI   25KD
 
 
图3  倒置荧光显微镜观测N/P =15时PLL-PEI-PEG /基因复合物在PBMC细胞中的促细胞凋亡作用
 
 
 
图4    流式细胞仪检测N/P =15时PLL-PEI-PEG /基因复合物在PBMC细胞中的促细胞凋亡作用
3 讨论
纳米医学已被广泛应用于肿瘤的诊断治疗中，并取得了巨大的研究进展[8-10]。而运用纳米医学治疗神经系统疾病也成为近年来研究的热点，从而安全高效的基因传输载体是实现基因治疗的关键之一[4-5]。越来越多的研究[11-13]中使用阳离子聚合物与非离子聚乙二醇（PEG）的共聚物作为基因载体，利用PEG在复合物纳米粒子表面形成中性的水溶性壳层，避免粒子在血液中聚集，减少粒子在传输过程中被网状内皮系统及巨噬细胞清除，并且对粒子正电荷产生屏蔽作用从而降低粒子的阳离子毒性。在迄今所发现的基因传输聚合物载体中，聚乙烯亚胺（PEI）与DNA的亲合性好，而且具有独特的“质子缓冲”功能，能够破坏酸性溶酶体并释放所负载的DNA。除了PEI以外，阳离子多肽PLL是获得广泛研究的另一种基因载体，PLL对DNA的复合效率较好，虽然具有一定的阳离子毒性，但是可以生物降解，所以在使用中不会产生累积毒性[14]。因此本实验合成并体外检测了PLL-PEI-PEG的理化特性、毒性和靶向传输及转染能力。
   基因载体的转染效率是和纳米材料载体或者复合体的细胞毒性相关的, 如果复合物的毒性比较高, 则相应的转染表达水平也要下降。MTT比色法是免疫学衡量细胞增值的经典方法, 本实验采用了MTT比色法研究PLL-PEI-PEG与PEI 25kD两种纳米材料载体各自复合pDNA后的细胞毒性。我们发现在PBMC细胞中,在N/P<15时,  PLL-PEI-PEG和PEI 25kD的细胞存活率比较基本相当, 差异无统计学意义, 但N/P>15时,PLL-PEI-PEG细胞存活率相对PEI 25kD下降, 从而。说明纳米材料在改造后同样用量的时候毒性大大降低了。
   为了衡量转染效果，各种材料的复合物在PBMC细胞中进行转染后，分别地在荧光显微镜下以及流式细胞仪检测。本研究证实在PBMC细胞中,PLL-PEI-PEG转染的荧光素酶基因表达水平比PEI 25kD高, 这可能是由于PBMC细胞是PLL受体高度表达的, 所以PLL-PEI-PEG荧光素酶基因表达水平相对PEI无PLL配体来调节的复合物要高。另外流式细胞仪检测结果也证实了荧光显微镜下观测所得的结果。由此可以得出， PLL-PEI-PEG-可以作为PBMC细胞基因传输的载体。
      总之, 本研究明确了PLL-PEI-PEG-Lf的基因转染效率及细胞毒性作用, 并证实了基因表达的可控性和稳定性，为靶向基因治疗MS寻找行之有效的基因载体提供了理论和实践基础, 可进一步用于动物体内进行联合基因治疗MS。
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