【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 PLL-PEG-PEI；体外基因转染；转染效率；多发性硬化
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正文：
摘 要 目的:合成可降解性多聚赖氨酸（PLL）-PEG-PEI并研究其负载质粒DNA的能力,比较所形成纳米材料/DNA复合物在体外对细胞的毒性大小及其转染效率,为进一步体内基因治疗做好准备。方法: 以PEI 25kD为对照，并化学方法合成可降解性PLL-PEG-PEI，检测所形成纳米材料/DNA复合物对PBMC的细胞毒性,并对细胞进行转染,分别用流式细胞仪、荧光素酶基因表达水平和倒置荧光显微镜检测转染效果。结果:PLL-PEG-PEI复合pDNA后,采用MTT法检测出复合物在PBMC细胞中的细胞毒性，并证实PLL-PEG-PEI细胞毒性比常用的PEI25ku低，在PBMC细胞中,转染效率从整体来看，N/P比=15时，PLL-PEG-PEI萤光素酶基因表达水平最高，类似的，通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜更直观的检测了转染效果，表明PLL-PEG-PEI对PBMC细胞有靶向效果且在N/P比为15时靶向效果最好。结论:此研究结果为多聚赖氨酸靶向基因治疗多发性硬化寻找行之有效的基因载体提供了理论和实践基础,可进一步于动物体内进行联合基因治疗多发性硬化。
关键词：PLL-PEG-PEI；体外基因转染；转染效率；多发性硬化
Novel targeted nanoparticles mediated gene therapy for multiple
 sclerosis in vitro
Dong Yan-Xian1，Shi Hong-Ting2，Liang-Bing3,Zhong Gao-xian 3，Diao Fang-Ming2
Yao Hui-Yan
收稿日期：
基金项目：广东省自然科学基金，批文号：S2013010011760
作者简介：董亚贤，第一作者，男，汉族，主任医师，神经免疫系统疾病；（E-mail：yaxiandong@163.com）。
          石红婷，通讯作者，女，汉族，医师，神经免疫系统疾病；（E-mail：317564816@qq.com）。
（通讯作者地址：广东省广州市亚运城亚运南路63号广州医科大学附属第四医院神经内科；电话：13416126065；E-mail：317564816@qq.com）
 
 
 
（1. Department  of  cerebrovascalar，The  First Affiliated   Union   Hospital  of  Guangzhou   Medical   University，Guangdond，510150；2 The   Forth Affiliated   Union   Hospital  of  Guangzhou   Medical   University ，Guangzhou  511447;3. The  Second Affiliated   Union   Hospital  of  Guangzhou   Medical   University ，Guangdond，510000）
Abstract  Objective:To enhance the transfection efficiency and to reduce the toxicity of the polyethyleneimine(PEI),we synthesized PEI derivatives and tested their toxicity and transfection efficiency in different celllines. Methods:We first developed PEG ylated PEI to decrease the toxicity of PEI,and then we conjugated poly-L-lysine（PLL） on the distal end of the novel PEG-PEI to introduce specificity for PBMC cells.Following we checked the characterization of polymers and tested their toxicity
and transfection efficiency in PBMC cell  with MTTassay,EGFP/fluorescent
image,reporter assay and flow cytometry.Results: These derivatives reduced the cytotoxicity of PEI 25ku in PBMC cell  .More importantly,compared with PEI 25ku,the transfection efficiency was increased.Reporter assay and flow cytometry showed that PLL-PEG-PEI/pDNA complexes exhibited higher transgene activity than that of PEI/pDNA in PLL-receptor（PR） positive cells but not PR-negative cells. Conclusions:These results indicated that PLL-PEG-PEI might be a promising candidate for gene delivery with the characteristic of good biocom patibility and relatively high gene transfection efficiency.
Keyword：PLL-PEG-PEI;In vitro gene transfer;Transfection efficiency; Multiple Sclerosis
多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS）是一种慢性、炎症性、脱髓鞘的中枢神经系统疾病[1]。MS的治疗比较困难，而免疫调节治疗是治疗多发性硬化症的主要策略，但这些免疫治疗方法尚不能做到特异性抑制对MS有关的免疫反应而不干扰免疫系统的正常功能，更非无毒且长期或永久有效。目前许多临床研究均证实[2-3] DNA重组和基因转染技术的发展使MS基因治疗从理论上的可能性成为现实性。
在基因治疗研究领域, 载体问题一直是至关重要的核心问题之一[4-5]。我们前期已经成功合成并验证了靶向、高效及可降解型聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）-聚乙烯亚胺( Polyethylenimine,PEI) [6-7] 。因此，本文合成多聚赖氨酸（Poly-L-lysine, PLL）-聚乙烯亚胺（PEI）-聚乙二醇（PEG） ( PLL-PEG- PEI) ，并研究了其负载质粒DNA( pDNA) 的能力，并在体外检测了其细胞毒性和转染效率，以便了解PLL-PEI- PEG的基因转染效率及细胞毒性作用，从而开发出更加高效、低毒和高靶向性的基因载体，有望突破多发性硬化治疗的瓶颈，为多发性硬化治疗带来新的希望。
1 材料与方法
1.1   细胞来源及培养
大鼠单个核细胞(PBMC)购自美国ATCC公司，由本实验室保存。用加有10%FBS和1％抗生素(青霉素/链霉素)的DMEM培养基在5%CO2培养箱37ºC中培养PBMC。
1.2 质粒DNA（pDNA）的制备
本研究应用能表达绿色荧光蛋白的pAAV-EGFP。质粒在大肠杆菌中扩增, 然后用QIAGEN试剂盒提取纯化。得到的质粒通过紫外分光计在260nm和280nm波长处检测其含量；在1.0%的琼脂糖凝胶上以100V电压电泳40min，检测其完整性。检测合格的质粒保存于- 20℃备用。
1.3 PLL-PEI-PEG /质粒DNA复合物的制备
   在Eppendorf管中，将1μg pDNA稀释在50μl不含FBS的DMEM中，振荡均匀，按不同N/P比把相应量的纳米材料加入到另外一管装有50μl不含FBS的DMEM的Eppendorf管中，然后把两溶液在室温下振荡5分钟得到均匀复合物。
1.4 琼脂糖凝胶电泳观测纳米粒与质粒的结合能力
纳米粒子溶液与pDNA按N/P比为0、0.5、1、2、3、5和10漩涡震荡混匀后，室温静置30分钟。上样前与6倍的琼脂糖染色剂Lodingbuffer混合,终体积约10-20ul，上样到含有EtBr(0.1ug/ml)的1.0%琼脂糖胶板上, 在PBS中以100V的电压泳动40分钟, 通过紫外灯观测DNA的迁移情况并摄片记录。
1.5 细胞毒性检测（MTT法）
PBMC细胞以每孔6000个细胞接种在96孔板中；24小时后每孔加入含有150ng 质粒DNA的纳米材料/pDNA复合物的150μl不含血清培养液进行转染，每个N/P浓度复制在四个孔中，48小时之后加入20μlMTT溶液(5mg/ml)，继续培养4小时，小心吸出孔内培养上层清液后，加入100μlDMSO，室温振荡5分钟后，通过化学发光酶标仪测定在570nm处的吸光值。
1.6 转染效果检测
1.6.1　转染过程    将细胞以1×105细胞每孔接种在24孔板上培养24h，待细胞丰度70％，在转染前4小时用不加FBS的DMEM培养基置换培养液，然后把其吸走后每孔加入含有1μg pDNA不同N/P比的PLL-PEI-PEG /质粒和200μl不含FBS的DMEM培养基，在37ºC下培养4h， 吸去转染液，加入完全DMEM培养基在37ºC下继续培养20h。
1.6.2  倒置荧光显微镜观测  pAAV-EGFP同纳米材料复合后对PBMC细胞转染后，弃去上层培养液，通过倒置荧光显微镜观测pDNA在PBMC细胞中的转染效果，照片用Nikon荧光软件捕获。
1.6.3  流式细胞仪检测   pAAV-EGFP同纳米材料复合后对PBMC细胞转染后，弃去上层培养液，细胞用500μlHank’s平衡盐溶液悬浮，然后应用FACS AriaTM系统计数表达绿色荧光蛋白的细胞的百分比。

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