【分　 类】 医药卫生
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正文：
摘要：目的：建立慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)大鼠模型，观察痰热清对COPD大鼠支气管上皮MRP1 mRNA的影响,探讨痰热清治疗COPD 的作用机制。方法:雄性Wistar大鼠30只，随机分为3组：COPD模型组，痰热清治疗组和正常对照组，每组各10只。除正常对照组，其余两组采用气管注脂多糖加熏香烟方法制备COPD模型， RT-PCR技术分析MRP1 mRNA基因表达。结果：COPD模型组和痰热清治疗组大鼠支气管上皮细胞中MRP1 的表达减少( (P<0.01)。与模型组比，痰热清治疗组大鼠支气管上皮细胞中MRP1 的表达增高(P<0.05)。结论：痰热清注射液可能通过增高大鼠支气管上皮细胞中MRP1 的表达达到有效减轻COPD气道炎症，达到延缓COPD肺功能恶化和改善症状的效应。
关键词：痰热清；COPD；MRP1 mRNA
ABSTRACT Objective To observe the effects of Tanreqingon the expression levels of MRP1 mRNA in the Brochial Epithelial Cells of COPD model rats，and to explore the mechanism of Tanreqing for treating COPD．Methods Thirty male wistar rats were randomly divided into the normal control group，the model group，and Tanreqing group．Except the normal control group，the COPD rat model was established in the rest groups using the methods of Tracheal injection of lipopolysaccharide and quantitative stimulation with tobacco. The expression of MRP1 mRNA of the pulmonary tracheal epithelium was detected by RT-PCR． Results  Compared with the normal control group，the expression of the bronchial epithelial MRP1 mRNA significantly decreased in the model group ．( P ＜0. 05) ． Compared with the model group，the expression of the bronchial epithelial MRP1 mRNA significantly decreased in the epithelium of the Tanreqing group ( P <0.05). Conclusion Tanreqing could effectively alleviate the lung inflammation，postpone the occurrence and development of COPD possibly through effecting the functions and expression of the bronchial epithelial MRP1 mRNA in COPD rats．
KEYWORDS Tanreqing； chronic obstructive pulmonary disease； MRP1 mRNA
 
慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)临床表现为不能完全逆转的气流受限，气流受限常呈渐进性发展，常伴有气道、肺实质与肺血管对有害颗粒和/或气体的炎症反应[1-3]。COPD多见于中老年人，作为呼吸系统的常见病和多发病，患病率和致死率居高不下。COPD的发生发展与炎症和氧化应激密切相关。多药耐药相关蛋白( multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)在肺支气管上皮有很强的表达。不仅可以作用于内源性代谢物，还具有调节细胞内药物、毒物及其代谢产物浓度的功能，是机体自身防御解毒体系的重要组成部分。[4]痰热清注射液是在“双黄连”、“清开灵”两种清热解毒中成药药方的基础上优选而成，具有清热解毒和化痰镇惊的作用。痰热清注射液对COPD急性加重期患者具有一定疗效[5]，但痰热清在治疗COPD的机理研究较少，本课题通过制备COPD大鼠模型，采用痰热清干预，检测COPD大鼠支气管上皮细胞中MRP1，探讨痰热清治疗COPD的可能机理，为临床用药提供评价依据，现将结果汇报如下：
1.试验动物与方法
1.1试验动物 SPF级健康Wistar大鼠30只，雌雄各半，体重180-220g，购于武汉大学医学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(鄂)2003-0004。随机分为.3个组别：COPD模型组，痰热清治疗组和正常对照组各10只，雌雄各半。 
1.2.COPD模型制备  COPD模型组和痰热清治疗组大鼠气管内注入脂多糖( Lipopolysaccharides，LPS)加熏香烟方法制备COPD模型。在d1和d14，将大鼠全麻，于气道注入溶于生理盐水的LPS200μL (1mg/mL )，正常对照组大鼠注入生理盐水。d2~d28(d14除外)将COPD组大鼠置入自制被动熏吸箱内(50cm´50cm´50cm)，注入香烟烟雾(牡丹牌香烟，上海卷烟厂生产，焦油、尼古丁和CO的含量分别为11.0mg/支、0.9mg/支和12mg/支)，浓度5%，1h/次，2次/d。正常组大鼠不进行熏吸。
1.3.治疗 COPD模型组和正常对照组尾静脉iv.0.9%氯化钠注射液，剂量2mL/kg，痰热清治疗组尾静脉iv. 痰热清注射液(上海凯宝药业股份有限公司生产，国药准字：Z20030054，规格：10ml/支，批号：20131001) 2mL/kg，所有组别连续给药14d，d15检测大鼠呼吸功能，RT-PCR技术分析MRP1 mRNA基因表达。并进行组间比较。
1.4.指标检测
1.4.1.大鼠呼吸功能测定 采用动物肺功能测定系统检测肺功能，即0.3s用力呼气容积占用力肺活量的比值(Forced expiratory volume in 0.3 second/Forced vital capacity，FEV0.3/FVC)、呼气峰流速(Peak expiratory flow，PEF)和肺顺应性(Dynamic lung complicance, Cydn)。采用10%水合氯醛(3ml/kg)ip.麻醉大鼠，仰卧位固定于操作台，测定肺功能。
1.4.2.肺组织标本病理 夹闭左主支气管，将硅胶管固定于右主支气，检测之前将血浆标本用SepPack C18(美国Cayman Chemical公司)分离柱抽提，洗出液用N2吹干，置入试管内，右肺内注射10%甲醛至右肺膨胀边缘变锐，结扎右主支气管，置于10%甲醛中固定、脱水、包埋、HE染色并行病理检查。
1.4.3　RT-PCR技术分析多药耐药相关蛋白(Multidrug resistance-associated Protein 1，MRP1) mRNA表达 用Trizol法提取肺组织中总RNA。MMLV逆转录酶和Oligo(dT)37℃下逆转录5min，42℃1h逆转录为单链cDNA。PRC扩增：采用Taq DNA多聚酶和正反引物(参见表1)存在下进行PCR，用β-actin和Marker D512为参照物，按以下步骤行PCR扩增：94℃变性，30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个周期。目标基因检测：采用琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察结果并进行拍照。采用Quantityone 4.6.2.版分析结果。
1.4.4. 统计学处理　所有数据输入SPSS16.0软件包中，计量资料使用“均数±标准差”表示，组间比较采用One Way ANOVA分析，以α=0.05为检验水平，P<0.05为差异有统计学意义。
 
2 结果
2.1.各个组别大鼠治疗前后的体重比较  实验期间，COPD模型组和痰热清治疗组大鼠的精神反应、活动和毛发与对照组比较，并观察有无大鼠死亡
所有组别大鼠入组前的体重无显著差异，制备COPD模型并给予治疗后，COPD模型组和痰热清治疗组大鼠体重增重缓慢，较正常对照组明显降低(P<0.05)，与COPD模型组比，痰热清治疗组大鼠较重(t=2.3, P<0.05)，可参见表1。
表1. 各个组别大鼠治疗前后的体重比较
组别
例数(只)
治疗前
治疗后
t
P

正常对照组
10
210.2±15.6
289.7±28.1
7.8
<0.05

COPD模型组
10
215.4±14.8
247.8±15.9
4.7
<0.05

痰热清治疗组
10
208.7±13.7
265.4±18.7
7.7
<0.05

F
0.6
9.5
--
--

P
>0.05
<0.05
--
--

 
2.2. 各个组别大鼠治疗后的肺功能比较  制备为COPD后，COPD模型组和痰热清治疗组大鼠的肺功能均有不同程度的降低(P<0.05)，与COPD模型组比，痰热清治疗组大鼠PEF明显改善(P<0.05)，FEV0.3/FVC和Cydn也有改善，但无统计学意义(P>0.05)，参见表2。
表2.各个组别大鼠治疗后的肺功能比较
组别
例数(只)
FEV0.3/FVC(´102)

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