【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】   中期因子；融合蛋白；纯化
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正文：

1、marker；2、pGEX-MK经BamHI和EcoRI双酶切产物
.
2、GST-MK融合蛋白在大肠杆菌中大量表达：结果显示，IPTG诱导蛋白的大小在37 kD左右，与GST-MK融合蛋白分子量接近，因此判断该蛋白为GST-MK。终浓度1 mmol/L IPTG在30℃诱导表达4 h，产生的可溶性目的蛋白的量最大（图3），因此选定在此条件下大量表达重组蛋白，从可溶性蛋白中纯化目的蛋白。
 
 
 
图3  SDS-PAGE电泳分析不同温度GST-MK可溶性表达
           M. marker；                1. IPTG诱导前；
          2. GST-MK，25℃诱导上清； 3. GST-MK，25℃诱导沉淀；
           4. GST-MK，30℃诱导上清； 5. GST-MK，30℃诱导沉淀；
           6. GST-MK，37℃诱导上清； 7. GST-MK，37℃诱导沉淀；
 
3、GST-MK融合蛋白和MK重组蛋白的纯化  破菌上清液经glutathione-Sepharose 4B 柱纯化，在谷胱甘肽洗脱液中得到较高纯度GST-MK融合蛋白质。经脱盐，Sepharose Q Fast Flow 阴离子层析柱进一步纯化后，用凝血酶对GST-MK融合蛋白进行酶切，酶切产物用Hi-Trap Heparin column纯化，得到高纯度MK重组蛋白（见图4）。
 
 
 
图4  亲和层析纯化后MK重组蛋白SDS-PAGE电泳图
1、重组MK蛋白；         2、酶切样品
3、GST-MK       4、流穿液；           
5、破菌上清；    M、Marker
 
4. GST-MK及MK蛋白的鉴定  Western blot结果显示，诱导表达的GST-MK及纯化MK蛋白条带分别出现在蛋白质分子量为37 kD和14 kD左右处，与其分子量的理论值相吻合，而未经诱导的菌体裂解液在相应的位置没有出现条带（见图5）。说明诱导的蛋白是重组人MK，而且具有免疫原性。
 
 
图5  Western blot 分析重组MK表达
 M. Marker；      1. GST-MK
 2. IPTG诱导前；  3. 重组 MK蛋白
5. 重组人MK蛋白生物活性鉴定  MK具有促进NIH3T3细胞增殖的活性，本试验选用NIH3T3细胞株检测纯化的重组人MK蛋白的生物活性。结果表明，在无重组人MK蛋白的无血清培养基中，NIH3T3细胞生长缓慢，在加入重组人MK蛋白后，细胞增殖速度明显加快，当浓度在10~1000 ng/ml时，这种促生长作用呈浓度依赖性（见表1）。因此，重组人MK具有一定的生物活性。
 
表1 重组MK蛋白对NIH3T3细胞增殖的影响
 
分组
NIH3T3

A490
增殖率(%)

对照
0.263±0.023
 

MK 10 ng/ml
0.306±0.020*
16.7

MK 30 ng/ml
0.33±0.045**
18.6

MK 100 ng/ml
0.342±0.027**
26.6

MK 300 ng/ml
0.358±0.035**
30.5

MK 1000 ng/ml
0.32±0.016**
17.8

`x ± s，n=3，* P﹤0.05，** P﹤0.01，与对照组比
 
讨论
近年研究表明，肿瘤血管生成是实体恶性肿瘤无限制侵袭生长和转移的基础，抑制血管生成就能显著抑制肿瘤生长。因此，以新生血管为靶点，对肿瘤进行抗血管生成治疗已成为当今临床治疗肿瘤的新策略。MK是近年来新发现的一个促血管生成因子。研究表明， MK高表达于食道、胃、结肠、胰腺、肝、肺、乳腺、膀胱癌及Wilm氏瘤等许多人类肿瘤组织及实质细胞外间质中的血管内弹力膜层及内皮细胞，尤以密集的血管处明显，而各种正常组织及正常血管内皮细胞不表达或仅有低水平表达[3~5]。利用MK抗体和反义核酸能抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤血管生成[6]。MK可能是肿瘤抗血管生成治疗中比较理想的靶分子，因此，获得具有生物活性的高纯度MK蛋白并研究其在实体肿瘤生长调节中的作用至关重要。
GST融合表达载体系统具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便等优点。我们在实验中选择GST表达载体系统进行融合表达，经IPTG诱导后MK-GST融合蛋白得到高效表达，融合蛋白被位点特异性蛋白酶裂解，除去GST蛋白。分离纯化后得到具有生物活性的重组MK蛋白，通过纯化的MK蛋白制备抑制肿瘤血管生成的MK结合肽[7]，实现肿瘤的靶向性抗血管生成治疗，本实验中原核表达载体的建立及MK蛋白的成功表达和纯化为后续研究奠定了基础。
参考文献
[1]Folkman J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis[J]. Semin Oncol, 2002,29:15-18，
[2]Choudhuri R, Zhang H T, Donnini S, et al. An angiogenic role for the neurokines midkine and pleiotrophin in tumorigenesis[J]. Cancer Res， 1997, 57: 1814-1819.
[3] Koide N, Hada H, Shinji T, et al. Expression of the midkine gene in human hepatocellular carcinomas[J]. Hepatogastroenterology，1999，46: 3189–3196.
[4]Aridome K, Tsutsui J, Takao S, et al. Increased midkine gene expression in human gastrointestinal cancers[J]. Jpn  J  Cancer Res，1995，86: 655–661.
[5] 谢平，陆永良，姚行，等. 中期因子和微血管密度在乳腺癌中的表达[J].中华实验外科杂志，2004，21：92-93. 
[6] Dai L C,Wang X,Yao X,et al. Antisense oligoncleotides targeting midkine suppresses in vivo angiogenesis[J].World  J Gastroenterol,2007,13:1208-1213.
[7] 沈建芬，闵丽姗，姚行，等. 从噬菌体肽库中筛选并鉴定中期因子特异性结合肽[J]. 中华实验外科杂志，2013，30（6）：1278-1280.
 

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