【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】   中期因子；融合蛋白；纯化
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正文：
 [摘要] 目的 构建人中期因子（midkine，MK）蛋白的原核表达载体，获得MK重组蛋白。方法  以质粒pBSK-MK为模板扩增MK基因，BamHI和EcoRI双酶切后克隆入原核表达质粒pGEX-1λT，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，超声粉碎，亲和层析柱纯化，重组蛋白用SDS-PAGE电泳、Western Blot和MTT法鉴定。结果 PCR产物大小及双酶切鉴定证明所克隆的基因是MK，DNA测序进一步证实与Genbank序列完全一致。SDS-PAGE电泳结果显示获得高表达及纯化的融合蛋白。Western blot证实为目的蛋白，具有抗原性。并能促进NIH3T3细胞增殖，有一定生物活性。结论 成功构建了原核表达载体pGEX-MK，并制备出具有活性的人重组MK蛋白。
[关键词]  中期因子；融合蛋白；纯化
Cloning, expression and characterization of recombinant human midkine
Shen Jian-Fen*, Min Li-shan, Dai Li-Cheng
*The First Hospital of Jiaxing，Jiaxing 314000, China
Corresponding author: Dai Li-Cheng 
 
Abstract
Aim: Cloning and expression of recombinant human midkine (rh-midkine) and investigation of its biological functions. Methods: human midkine (h-midkine, h-MK) gene fragment was obtained from pBSK-MK plasmid, cloned into pGEX-1λT plasmid, and transformed into  E.coli BL21(DE3). The GST-fused midkine protein was expressed with the induction of IPTG. By affinity chromatography, the rh-midkine was purified and following detected by SDS-PAGE and Western Blotting. MTT method was used for its biological function analysis. RESULTS: Restricted-enzyme digestion and sequencing results showed that the target gene was inserted correctly into the expression vector. SDS-PAGE analysis show that the fusion protein GST-MK and rh-midkine was successfully soluble expressed and purified. Western Blotting showed that the rh-midkine had good antigenicity to natural midkine protein. Rh-midkine promote the proliferation of NIH3T3 cells in a dose- dependent manner,
suggesting the biological functions of this protein. Conclusion: The recombinant plasmid pGEX-MK was successfully constructed，Soluble Rh-midkine was successfully expressed and purified.
 
Key words: midkine; fusion protein; purification
 
肿瘤的生长有赖于血管生成[1]。中期因子是近年新发现的一个促血管生成因子[2]。MK的这一作用使其成为血管增生性疾病治疗的潜在靶标。我们以质粒pBSK-MK为摸板，扩增MK基因，构建基因重组体pGEX-MK，并制备具有生物活性的MK重组蛋白用于后续实验。
材料与方法
1. 材料：包含MK基因完整cDNA质粒pBSK-MK由本室保存。感受态细菌BL21(DE3) 购自Novagen公司。原核表达载体pGEX-1λT, glutathione-Sepharose 4B柱、 Sephadex G25柱、Sepharose Q Fast Flow 阴离子层析柱和Hi-Trap 肝素柱 为 瑞士Amersham-Pharmacia biotech公司产品。高保真DNA聚合酶购自美国NewEngland Biolabs公司。限制性内切酶 BamHI、 EcoRI 和T4 DNA 连接酶均购自美国Roche 公司。引物合成由上海生工公司完成。牛血清白蛋白、MTT和异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 为 Invitrogen公司产品。MK 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司。NIH3T3细胞由浙江大学传染病研究所提供。
2. 重组质粒pGEX-MK的构建：MK基因由质粒pBSK-MK为模板，经PCR扩增得到。扩增引物分别为Sense: 5’–TTTT GGATCC aaa aag aaa gat aag gtg aag–3’，Antisense: 5’–TTTT GAATTC gtc ctt tcc ctt ccc ttt ctt–3’。 PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45 s，52℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共循环30次，最后72℃延伸10 min。PCR反应产物纯化后，应用BamH I和EcoRI双酶切PCR产物和表达载体pGEX-1λT，1.2％琼脂糖电泳后回收酶切产物，用T4连接酶连接，构建重组的质粒pGEX-MK。筛选重组质粒阳性克隆，收集其DNA样品。一部分样品送上海生工公司测序，剩余部分用限制性内切酶（BamHI，EcoRI）酶切后，将酶切产物及PCR产物加样于1.2％琼脂糖凝胶电泳，分析DNA片断长度同预期片断长度是否相符，从而鉴定是否含有正确插入的MK片断。
3. GST-MK融合蛋白的诱导表达：以上获得的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3) （Novagen），挑取单菌落接种于3 ml 2YT液体培养基（含100 µg/ml的氨卞青霉素）37℃振摇过夜后，按1：100稀释度进行扩大培养。培养至OD600达到0.3-0.6时，加入IPTG至终浓度为0、0.25、0.5、0.75，1 mmol/L，分别于37℃诱导2，4，8，16 h后收获菌体，用PBS重悬，超声波破碎细胞后离心，经15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后，用凝胶成像系统分析。以确定最佳表达时间和IPTG最佳诱导浓度。再以1 mmol/L IPTG分别于25℃，30℃，37℃诱导表达菌株4 h后收获菌体，上清和沉淀分别经15％SDS-PAGE电泳以分析目的蛋白主要以可溶形式表达还是形成包含体并确定最佳表达温度。以未加IPTG诱导前的菌总蛋白作对照。
4. MK重组蛋白的分离及纯化：取包含可溶性蛋白的上清液，装入已用4倍柱体积的PBS 预平衡的 glutathione-Sepharose 4B 柱。用PBS洗去非特异结合蛋白，3倍于柱体积的洗脱缓冲液（包含50 mM Tris–HCl (pH 8.0)，10 mM还原型谷胱甘肽）洗脱GST 融合蛋白。收集目标蛋白加入已用20 mM PB（PH7.0）预平衡的Sephadex G25 柱脱盐 。收集富含GST-MK 混合液加入已用20 mM PB（PH7.0）预平衡的Sepharose Q Fast Flow 阴离子层析柱，用0 ~0.5 mol/L NaCl（溶于20 mmol/L PB）(pH 7.0) 梯度洗脱，控制流速为10 ml/min.。纯化的GST-MK溶液中加入10 U 凝血酶/ 1 mg GST-MK，22℃ 孵育16 h后加入到已用buffer A(20 mM PB, pH 7.0)预平衡的Hi-Trap肝素柱。用含1.0 ~1.5 M NaCl缓冲液以1.0 ml/min流速逐步洗脱得到MK。将纯化后的产物进行SDS-PAGE分析
5. Western blot方法进行MK重组蛋白的鉴定  将纯化后的GST-MK 融合蛋白和MK重组蛋白经10％SDS-PAGE电泳分离后，以200 mA恒流电转1.5 h，将蛋白转至PVDF膜上。室温下，PVDF膜用脱脂奶粉封闭1 h，随后加入兔抗MK单克隆抗体(效价1：1000)。4 oC过夜后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔lgG室温孵育1 h，TBS洗膜3次，化学发光试剂盒检测MK表达。
6. MTT法检测MK重组蛋白生物活性：取对数生长期NIH3T3细胞接种至96孔板，200 ml/孔，3×103个细胞/每孔，每组设3孔，重复3次，37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞出现60~80％融合后，换无血清培养基培养24 h后，加入不同浓度MK重组蛋白，设不加MK重组蛋白孔为空白对照。继续培养48 h后，每孔加20 ml MTT，37℃，5％CO2培养箱孵育90 min，测定490 nm光吸度值（A490），通过细胞生长倍增数量评价MK重组蛋白对NIH3T3细胞生长的影响，计算细胞增殖率。增殖率（%）＝[（A490用药－A490对照）/ A490对照] ×100％。
结果
1. 重组质粒pGEX-MK的鉴定：琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR产物位于363 bp附近（见图1），与MK基因大小一致。重组质粒双酶切产物分别位于相当于载体和目的基因的位置（见图2）。上海生工公司序列进一步证实重组质粒的序列正确， MK基因的编码片段和载体GST在同一读码框。
 

图1  MK基因PCR扩增电泳图
 M、marker；1、PCR扩增产物；2、PCR扩增产物
 

 
图2 重组质粒pGEX-MK酶切鉴定图

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