【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 系统性红斑狼疮；骨髓上清；间充质干细胞；细胞衰老
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正文：

1.2.7 Annexin V/PI检测凋亡
用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化细胞，PBS洗涤2遍；200μl 1×Binding Buffer 细胞重悬约106/ml；取100μl细胞悬液，加PI 10μl、FITC-Annexin V 5μl；室温 避光孵育15min；流式细胞仪检测；
1.3统计学处理
实验数据结果以均值标准差（±S）表示，采用SPSS19.0数据分析，GraphPad Prism5软件作图，样本间差异分析采用t检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 SLE患者骨髓上清增加β半乳糖苷酶阳性MSC比例
与健康对照组相比，SLE患者骨髓上清可增加MSC细胞β半乳糖苷酶活性，如图1A所示蓝染细胞。SLE骨髓上清处理组中MSC平均β半乳糖苷酶阳性比例[(29.8±6.3)%]显著高于健康骨髓上清处理组[(12.6±2.3)%]（图1B，p<0.01）。
 
图1对照和SLE患者骨髓上清对MSC胞内β半乳糖苷酶表达的影响
（蓝染细胞为β半乳糖苷酶染色阳性细胞，n=6，** p<0.01）
2.2 SLE患者骨髓上清上调p53和p21的表达量
与健康对照组相比，SLE患者骨髓上清培养可明显增加MSC胞内细胞周期调控分子p53和p21的蛋白表达量（图2A）；此外，SLE骨髓上清亦显著升高p53和p21的基因表达水平（图2B，* p<0.05）。
 
图2 健康对照者及SLE患者骨髓上清对MSC胞内p53和p21表达量影响
（n=6，* p<0.05）
2.3 SLE患者骨髓上清诱导MSC DNA损伤反应
将MSC分别培养在健康对照者及SLE患者骨髓上清中2天，免疫荧光检测MSC胞内DNA损伤分子的表达情况。结果发现SLE患者骨髓上清可使DNA损伤分子53BP1表达增加（图3），提示此组MSC核内DNA损伤较对照组严重。
 
图3 健康对照者及SLE患者骨髓上清对MSC核内DNA损伤反应的作用
（蓝色代表细胞核DAPI，红色代表胞核53BP1，n=6）
2.4 SLE骨髓上清抑制MSC增殖
与健康对照组相比，SLE患者骨髓上清可促进MSC细胞凋亡[(24.6±4.1)% vs. (10.1±2.4)%，p<0.01]，而该培养体系中MSC增殖则呈下降趋势[(1.1±0.2) vs (0.8±0.2)，p<0.01]（图4），提示SLE患者骨髓上清可促进MSC凋亡、抑制其增殖。
 
图4 健康对照者及SLE患者骨髓上清对MSC凋亡和增殖的影响
（n=6，**p <0.01）
3. 讨论
SLE患者体内存在多种免疫失衡，如T/B淋巴细胞异常活化、调节性T细胞数量及功能下降、巨噬细胞吞噬凋亡细胞减少，释放核小体增多，最终导致自身抗体的产生[11-14]。而MSC具有强大的免疫调节功能，可迁移至损伤部位，通过细胞间接触或可溶性因子（IDO等），进而抑制大量的免疫细胞活化与增殖[15, 16]。因此，针对MSC能否有效控制SLE，正常发挥其免疫调节功能显得尤为关键。我们既往研究证实SLE患者自身骨髓MSC功能存在多种异常，包括生长减慢、凋亡及衰老增加、免疫调节异常、迁移能力下降等[1-3]。而衰老的MSC存在迁移、抗炎调节功能等异常，故本研究重点关注MSC衰老，并探讨SLE患者机体微环境对MSC衰老的可能作用。
目前研究较多的细胞衰老相关基因主要包括p53、p21和p16等。肿瘤抑制基因p53是细胞生长的负调节因子，可能与机体的分化及衰老有关，且发现衰老的细胞都有高水平的p53表达；p53通过诱导表达p21来诱导细胞周期停滞。由于细胞衰老缺乏特异性标记，本研究采用β半乳糖苷酶染色及p53/p21的表达联合评估细胞衰老[17]。本研究发现SLE患者骨髓上清可增加MSC胞内β半乳糖苷酶活性、上调p53/p21蛋白和基因的表达水平。与此同时，该体系还可使MSC细胞凋亡增多、增殖能力下降，提示SLE患者骨髓微环境可诱导MSC衰老。
无论是复制性衰老，或是其他应激引起的细胞衰老，DNA损伤反应都是其中的关键步骤[18]，DNA损伤可激发下游的p53/p21/Rb途径介导细胞衰老。而细胞衰老时端粒快速缩短，并导致p53与DNA结合活性增加。53BP1蛋白作为p53结合蛋白，也是DNA损伤反应的蛋白标记之一。我们发现在SLE患者骨髓上清培养的MSC胞核内53BP1表达明显增多，提示SLE患者骨髓微环境引起MSC细胞内p53与DNA 结合活性增加，且DNA损伤较严重，这一系列过程最终可导致MSC衰老增加。
综上，我们的研究初步证实SLE患者骨髓局部微环境对MSC衰老起很重要的作用，且与其DNA损伤相关。但是，骨髓环境中到底何种物质对MSC的衰老起重要作用尚不清楚。只有明确了SLE患者体内MSC异常的可能原因，我们才能通过阻断机体循环或局部诱导MSC衰老的关键物质，延缓间充质干细胞的衰老，逆转MSC对免疫细胞的多种免疫调节功能，从而为临床改善机体内环境促进MSC发挥更好的调节作用提供新的依据。
 


参考文献
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