【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 系统性红斑狼疮；骨髓上清；间充质干细胞；细胞衰老
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正文：
摘要：为了探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者骨髓局部微环境对间充质干细胞（MSC）衰老的影响及机制。首先收集性别、年龄匹配的健康对照者及SLE患者骨髓各6例，留取上清液并灭活补体；以含10%骨髓上清的DMEM/F12培养基模拟机体骨髓局部微环境，培养脐带来源的MSC；SA-β-gal染色并计数阳性MSC比例；Real time PCR及Western Blot法分别检测MSC的p53、p21基因及蛋白表达水平；荧光显微镜观察MSC核内DNA损伤标记53BP1的表达情况；CCK8检测细胞增殖；流式细胞术检测Annexin V/PI评估细胞凋亡。结果显示，与正常对照相比，SLE患者骨髓上清可显著增加β半乳糖苷酶阳性MSC细胞比例，且上调p53和p21的表达量；在SLE患者骨髓上清处理的条件下, MSC细胞内与DNA损伤反应有关的标志性蛋白53BP1的表达水平显著增高；SLE患者骨髓上清还能够明显抑制MSC的增殖能力。这提示SLE患者骨髓上清促进MSC衰老，其机制可能在于诱导MSC细胞核内DNA损伤反应。
关键词：系统性红斑狼疮；骨髓上清；间充质干细胞；细胞衰老
中图分类号：R593.24  
 
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种全身炎症性自身免疫病，伴随T、B淋巴细胞的异常活化，抑制免疫细胞活化有利于控制狼疮病情进展。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC) 是一种存在于骨髓的基质细胞，更重要的是，它还有向损伤部位迁移、免疫调节等功能，这对于免疫功能异常或紊乱的自身免疫病（如SLE）尤为重要。我们前期研究发现SLE 患者骨髓 MSC 在生长、凋亡、衰老、免疫调节、迁移等多方面存在异常[1-3]。这些表明SLE患者自体骨髓MSC缺陷，无法正常发挥其调节功能。但迄今为止，SLE患者骨髓MSC异常衰老的原因尚不清楚。
近期有文献报道衰老的MSC迁移能力下降、抗炎能力减弱[4]。而细胞衰老表现为细胞周期阻滞、生长调控蛋白（如p53、p21、p16等）异常表达、细胞形态改变、β-半乳糖苷酶活性增强等[5]。Meira等人报道慢性炎症可诱导细胞内DNA损伤[6, 7]；而DNA损伤可加速细胞衰老进程[8]。此外，在DNA损伤反应（DDR）过程中53BP1（p53结合蛋白）、γ-H2AX等异常聚集[9, 10]；而干扰或下调53BP1则可逆转细胞DNA损伤反应，提示DNA损伤反应蛋白53BP1在细胞衰老过程中亦起到重要作用。目前DNA损伤在MSC衰老中的研究尚未见报道。
曾有报道部分促炎因子（如干扰素a、g等）可促进MSC衰老，而SLE作为一种全身性炎症性疾病，其骨髓微环境可能对MSC的衰老或功能产生影响。因此，本研究旨在探讨SLE患者骨髓局部微环境（骨髓上清液）对MSC衰老的作用及其可能机制。
 
1.材料与方法：
1.1 材料
1.1.1 实验试剂
培养基（DMEM/F12）、青/链霉素（Penicillin/Streptomycin）、胎牛血清（FBS）（GIBCO公司）；兔抗人p53单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体、羊抗兔二抗（CST公司）；兔抗人p21单克隆抗体（Santa Cruz公司）；兔抗人53BP1一抗，Phycoerythrin（PE）标记的荧光二抗（Invitrogen公司）；DAPI细胞核染色剂（Life Technology公司）；细胞衰老检测试剂盒（Chemicon公司）；Trizol试剂、Real Time PCR试剂盒（TaKaRa公司）。
1.1.2 实验对象
南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科2011年9月至2012年9月收住院的6例女性SLE患者，诊断符合美国风湿病学会1997年修订的SLE分类标准，均处于活动期，SLEDAI评分≥8分；健康对照者来自本院6例骨科外伤手术患者，无免疫病病史及家族史，性别、年龄匹配。收集上述人群的骨髓，肝素抗凝，离心取上清液体，56℃、30 min补体灭活，-80℃保存备用。脐带组织来自南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科健康产妇，无自身免疫病病史或家族史。
1.2 方法
1.2.1 脐带间充质干细胞（MSC）分离培养
脐带组织无菌采集后，置于含1%双抗的DMEM/F12中4℃保存。无菌状态下，分离脐带中的华通氏胶组织，去除静脉及动脉，将胶组织剪成1mm3的小块接种入T75培养瓶中，采用含10% FBS的DMEM/F12培养基培养，置于温度37℃、5% CO2的孵箱中。每3-5天换液一次，倒置显微镜下观察，生长至80%融合时，采用0.25%含EDTA的胰酶消化处理，收集悬浮细胞洗涤，按照1:3的比例传代接种，扩增、备用。在每次MSC传代时，台盼兰染色计算细胞活力大于95%，细胞冻存后复苏活力大于85%。流式细胞仪检测干细胞纯度：阳性指标CD73、CD90、CD105表达率>95%，阴性指标CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表达率<2%。
1.2.2  β-半乳糖苷酶染色
将MSC 2×104铺至六孔板，待细胞50-60%融合，加入含有10%正常人或SLE患者骨髓上清的DMEM/F12。培养3天后，弃去培养基，2ml PBS洗涤一次，加入1ml 固定液，室温孵育10-15min，吸出固定液，2ml PBS洗涤2次，加入2ml 1× SA-β-gal 测定液，37℃、无CO2、避光条件下染色过夜。吸出染色液，2ml PBS洗涤2次，光学显微镜下数蓝染细胞数，每次随机挑选8-10个视野，计算阳性细胞比例。
1.2.3  Western blot法
将MSC置于含10% SLE患者或对照者骨髓上清的DMEM/F12中培养3天，提取总蛋白。12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转印到PVDF膜上。用TBST [10 mmoL/L Tris-HCl (pH 7.6)，150 mmol/L NaCl，0.05％ Tween-20]洗3次，之后用5％的脱脂奶粉封闭1 h，p53/p21/GAPDH一抗杂交过夜，TBST洗3次，再用辣根过氧化物酶标记的二抗杂交2 h，TBST洗3次，最后用ECL显影剂检测。
1.2.4  Real time PCR（SYBR Green法 ）
MSC置于含10%健康对照者或SLE患者骨髓上清的DMEM/F12中培养2天，提取RNA，根据TakaRa逆转录试剂盒说明逆转录成cDNA。以适量 cDNA为模板，在 Taq聚合酶催化下行 real-time PCR反应，PCR循环条件设置：95℃，15s→（95℃，5s→60℃，30s）×40 循环。选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照基因，p53ΔΔCT＝SLE血清处理组（CT p53－CTGAPDH）－正常血清处理组（CTp53－CTGAPDH ）；p21ΔΔCT＝SLE血清处理组（CT p21－CTGAPDH）－正常血清处理组（CTp21－CTGAPDH ）。引物序列如下：GAPDH 上游5’-AGGCTAGCTGGCCCGATTTC-3’，下游5’-TGGCAACAATATCCACTTTACCA GA-3’；p53上游5’-TCAGCATCTTATCCGAGTGGAA-3’，下游5’-TGTAGTGGATGGTGGTACAGTCA -3’；p21上游5’-GAAGACCATGTGGACC TGTCACT -3’，下游5’-GAAGATCAGCCGGCGTTTG -3’。
1.2.5  CCK8检测增殖
96孔板加入细胞100μl/孔（1×104），以10% 健康对照者及SLE患者骨髓上清的DMEM/F12重悬，置37℃ 5% CO2细胞培养箱培养3天；向各孔中加入10μl的新型细胞增殖及毒性(CCK8)检测溶液；37℃孵育0.5h、1.0h、2.0h（对照组OD值控制在1.0左右）；酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度。
1.2.6 免疫荧光染色
将灭菌预处理的盖玻片置于六孔板内，铺入以10% 健康对照者及SLE患者骨髓上清的DMEM/F12重悬的MSC（2×104），培养2天。取出细胞爬片于细胞培养皿里，PBS洗三遍；4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍；0.2% Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍；与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍；兔抗人53BP1的一抗37℃ 2小时，PBS洗三遍；PE标记的荧光二抗室温2小时(避光)，PBS洗三遍；DAPI染核，荧光显微镜观察。

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