【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 天花粉蛋白；表皮生长因子；免疫毒素；靶向治疗
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正文：
摘要：目的  使用 EGF-TCSredlk 重组蛋白对裸鼠的肿瘤模型进行体内抑瘤实验，观察其抗肿瘤效果。方法 分别给裸鼠皮下接种人肝癌 BEL-7402 细胞，接种后第 6 天，尾静脉注射100、50 和 25 μg/kg EGF-TCSredlk 进行治疗，设空白对照组，停药后第 2 天处死小鼠，称量瘤重，计算抑瘤率；肿瘤组织做免疫组织化学实验，从而研究其抑制肿瘤生长的途径。结果 高、中和低剂量组的抑制率分别为 75.5%、54.5%和 35.4%。对治疗结束后各组平均瘤重进行统计学分析，结果有显著性差异(Welch=82.617，P=0.000)；免疫组化结果显示 EGF-TCSredlk 可以明显的抑制肿瘤血管的形成，高剂量组肿瘤组织未有可见血管，中低剂量组肿瘤组织血管明显少于模型组，其抑制肿瘤生长的途径可能是通过抑制肿瘤血管生长从而达到治疗目的。结论  EGF-TCSredlk 可以有效地抑制荷瘤小鼠实体瘤的生长，预示了该免疫毒素在肿瘤治疗中的潜在应用价值。
关键词：天花粉蛋白；表皮生长因子；免疫毒素；靶向治疗
Antitumor effect of recombinant immunotoxin EGF-TCSredlk on tumor-bearing mouse model
LI-yongmei, HUO-yunhua, YANG-minghui *
Department of Traditional Chinese Medicine,General Hospital of People’s Liberation Army,Beijing 100853,China
Abstract  Objective: To further observe the anti-tumor effect of recombinant toxin, we carried tumor inhibition test in vivo in naked mouse tumor model. Methods: The hepatoma cell BEL-7402 was inoculated subcutaneously on right armpit in naked mice and EGF-TCSredlk was injected intravenously (100 ,50 ,25 μg/kg) to mice for therapy after 6 days of inocluation. There was control group and mice were killed after 2 days of drug withdrawal, and the tumors were weighed and the tumor inhibitory rate was calculated;Tumor tissues were examined by immunohistochemistry.Result: The illustrated that EGF-TCSredlk could inhibit tumor growth markedly. The inhibition rate was75.5%、54.5%and 35.4%  for high dosage group, middle dosage group and low dosage group respectively. Variance analysis illustrated that EGF-TCSredlk could markedly inhibit the growth of naked mouse tumors,variance analysis had significant difference(Welch=82.617,P=0.000);Immunohistochemistry experiment showed that EGF-TCSredlk could makedly inhibit tumor angiogenesis. There were no visible blood vessels in tumor tissues in high dosage group and there were fewer blood vessels in tumor tissues in middle and low dosage group than those in control group, which revealed that perhaps EGF-TCSredlk inhibited tumor growth and migration by inhibiting tumor angiogenesis. Conclusions: EGF-TCSredlk can inhibit the growth of solid tumors in tumor-bearing mice and the priliminary results suggested the potential applications of this preparation in cancer therapy.
KEY WORDS: trichosanthin; epidermal growth factor; immunotoxin ;targeted therapy
重组免疫毒素治疗肿瘤的基本原理是寻找一种对肿瘤细胞有专一行亲和能力的 “生物导弹”，近年来利用基因工程技术构建了不同用途的免疫毒素[1，2]。研究表明，免疫毒素分子量更小、更易渗透至肿瘤组织、不容易产生抗体，但机体对毒素蛋白部分仍会产生免疫反应，有人认为短期大量用药会减少这一副作用。此外，肿瘤细胞表面存在的特异性靶抗原是导向治疗的前提，在体内具有靶向性，更易于与肿瘤细胞结合，对正常细胞的毒副作用很小，有很高的抑瘤率。在我国肝癌的发病率很高，长期以来一直缺乏十分有效的治疗方法，应用免疫毒素治疗肝癌不失为一种有益的尝试。本实验室已成功地制备了新型免疫毒素 EGF-TCSredlk，本实验以荷人肝癌裸鼠为模型，观察其在体内对荷瘤小鼠的抑瘤效果，为肿瘤的治疗提供一条新的思路。
1 材料与方法
1.1  主要试剂
重组免疫毒素 EGF-TCSredlk 由本实验室制备、保存；RPMI-1640 培养基购自 GIBCO 公司；新生牛血清购自杭州四季青生物制品公司；DAB 显色剂、vWA 兔多抗购自 Dako 公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2  细胞株及培养
肝癌 BEL-7402 细胞株购自北京协和药物研究所，用含 10% 小牛血清的RPMI-1640 培养基培养、传代，采取贴壁细胞培养法，在 5% CO2、37℃ 孵箱中培养。
1.3  实验动物
裸鼠 20 只，体质量( 20±2 )g，雌雄各半。购自军事医学科学院实验动物中心，分笼饲养，自由摄食、饮水。在清洁级实验动物饲养中心内饲养。
1.4 荷肝癌裸鼠动物模型的建立
体外培养生长活跃的肝癌 BEL-7402 细胞经胰酶消化、收集并离心，用 PBS配成 1 × 107/ml 的单细胞悬液，分别以 0.2 ml/只 的剂量接种于饲养的裸鼠右腋皮下。约 5 d 左右即可见肿瘤生长。待肿瘤长至 0.3 cm × 0.3 cm 时开始实验。 
1.5  分组及给药
将 20 只小鼠随机分成 4 组，对照组和治疗组，每组 5 只，经尾静脉给予治疗组注射不同剂量的免疫毒素 EGF-TCSredlk，治疗 Ⅰ 组、治疗 Ⅱ 组和治疗 Ⅲ 组剂量分别为 25、50和 100 μg/kg，对照组给予注射相同体积的生理盐水。每日 1 次，连续 7 天。
1.6 小鼠体内抑瘤实验　
停药 1 天 后处死小鼠，剥离瘤体，称瘤重，计算抑瘤率。肿瘤抑制率按以下公式计算：
肿瘤抑制率=[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100 %
1.7  肿瘤的病理变化观察
按EnVision TM试剂盒(丹麦DAKO基因公司)说明操作如下：
(1) 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3min。
(2) 对组织抗原进行高压修复。
(3) 每张切片加50μl 3％过氧化氢阻断溶液（试剂A），室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化酶的活性。PBS冲洗3次，每次3min。
(4) 除去PBS液，每张切片加50μl正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育10分钟。
(5) 除去血清，每张切片加50μl第一抗体，4℃过夜。
(6) PBS冲洗3次，每次3-5min。除去PBS液，每张切片加50μl生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育30min。PBS冲洗3次，每次3min。
(7) 除去PBS液，每张切片加50μl链霉菌抗生素-过氧化氢酶溶液（试剂D），室温下孵育10min。PBS冲洗3次，每次3min。
(8) 除去PBS液，每张切片加100μl新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)溶液，显微镜下观察3-10min。
(9) 自来水冲洗，苏木素复染，氨水返篮。
(10) 切片常规梯度酒精（70％、80％、90％酒精5分钟各1次，95％酒精5分钟2次，100％酒精5分钟3次）脱水之后，二甲苯透明，50％中性树胶封片。一抗工作浓度：vWA抗体( 1:200 )，微波炉中进行抗原修复，DAB 显色，苏木精复染。电镜观察组织结构变化。
1.8 统计方法 
应用SPSS 11.0软件进行数据处理，结果采用均数±标准差表示。
2  结果 
2.1  EGF-TCSredlk 对荷人肝癌小鼠体内抑瘤实验结果
模型组平均瘤重 （6.04±1.06)g，治疗Ⅰ组平均瘤重(3.90±0.32)g，治疗 Ⅱ 组平均瘤重（2.75±0.32)g，治疗 Ⅲ 组平均瘤重 （1.48±0.21)g，(Welch=82.617，P=0.000)，组间比较采用Tambane’s T2法，三组分别与对照组相比，差异有显著性意义（P<0.05）；各组相比有统计学意义（P<0.01）。三组抑瘤率分别为35.4％、54.5％、及75.5％。

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