【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 表没食子儿茶素没食子酸酯；缺血再灌注；NF-κB P65；TLR4；Balb /c小鼠
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正文：

1.2. 5 统计学处理
采用SPSS16.0统计软件分析，数据以± s表示，两样本均数的比较采用t检验，多组间数据比较采用方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2  结  果
2.1血清学检查结果
缺血30min，再灌注6h后，EGCG组血清AST、ALT水平较I/R组均明显降低 [（823.00±200.25）vs（1143.33±268.66），（715.33±159.15）vs（1295.00±214.39），P ＜ 0. 05]，血清AST/ALT明显升高[（1.16±0.16）vs（0.85±0.22），P ＜ 0. 05]；与Sham组比较，EGCG组血清AST、ALT水平均显著升高[（823.00±200.25）vs（349.00±39.24），（715.33±159.15）vs（205.00±28.35），P ＜ 0. 01]，血清AST/ALT显著降低[（1.16±0.16）vs（1.72±0.29），P ＜ 0. 01]。（见图1）
 
图1  EGCG作用后各组样本血清AST、ALT、AST/ALT指标检测
Fig. 1  Mean concentrations of AST and ALT in serum after treat with EGCG
肝组织病理学改变
肝脏缺血30min，再灌注6 h后，I/R组光镜下见肝中央静脉、肝窦内淤血，广泛肝细胞变性坏死，汇管区大量炎细胞聚集，部分肝组织结构破坏不完整，肝组织损伤分级Ⅱ级；EGCG组主要以肝细胞局灶性及片状坏死为主，汇管区炎细胞浸润，中性粒细胞为主，部分肝窦扩张、淤血，肝细胞可见不同程度的水肿变性和空泡状变性，偶尔可见点状坏死，肝小叶结构不完整，肝组织损伤分级Ⅰ级；Sham 组未见明显肝细胞坏死改变，肝小叶及肝细胞索结构完整、未见灶性坏死，中央静脉、肝窦均正常，肝组织损伤分级0 级。（见图2）
 
图2  EGCG作用后各组左外叶肝组织病理学改变（200×）
Fig. 2  Each group left lateral lobe of the liver histopathology treated with EGCG
 (HE staining, original magnification: ×200).
NF-κB P65及TLR4免疫组织化学结果
免疫组化检测NF-kB P65及TLR4分别在Sham组、EGCG组和I/R组左外叶肝组织的表达，TLR4主要表达在肝细胞胞膜上，少量表达在细胞质内，NF-kB P65主要表达在肝细胞胞质，同时也有少量表达在细胞核内。（见图3）Sham组、EGCG组、 I/R组TLR4指标得分分别为2.83±0.98分、5.67±1.51分、8.33±2.25分，Sham组、I/R组、EGCG组NF-kB P65指标得分分别为3.00±0.98分、6.67±1.97分、9.00±1.55分。可见，EGCG作用于Balb/c小鼠缺血再灌注肝后能同时抑制TLR4、NF-κB P65蛋白的表达。
 
图3  EGCG作用后各组左外叶肝组织NF-κB P65及TLR4蛋白表达量的改变（200×）
图A、B、C为NF-κB P65的表达，图E、F、G为TLR4的表达。
Fig. 3  NF-κB P65 and TLR4 protein expression changes in each group left lateral lobe of the liver after EGCG treatment( Immunocytochemical Staining, original magnification: ×200).
3  讨  论
EGCG是绿茶中提取出来的含量最高且生物活性最强的一种儿茶素，约占绿茶儿茶素总量的50%-75%[13]，具有抗炎症、抗氧化、清除自由基、抗突变和抗肿瘤形成等多种生物学活性和药理效应[14]，且在治疗剂量范围内，EGCG对正常机体组织细胞无明显不良反应[15]。 目前，我们对EGCG抗炎机制的研究相当多，EGCG可通过抑制BALB/3T3细胞中冈田酸（okadaic acid）诱导的TNF-α基因的表达[16]。也有研究证明，其机制是通过抑制巨噬细胞由脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和干扰素-γ（interferon-γ）诱导的NO的产生[17]。另外，EGCG还可以减轻自身免疫性疾病的炎症反应，如炎症性肠病[18]。本研究选用了Babl/c小鼠为实验对象，观察EGCG对肝缺血再灌注损伤的作用效果及探讨其可能作用机制，结果显示EGCG组较I/R组缺血再灌注肝叶组织损伤程度明显减轻，血清ALT、AST明显改善，缺血再灌注肝叶中TLR4及NF-κB P65蛋白阳性表达率明显减少。
Toll样受体（toll-like receptors, TLRs）是新近发现一类重要的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs），属于跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成，能有效识别异己成分而被活化，通过直接增强固有免疫细胞吞噬和杀伤能力，促进细胞因子和趋化因子的分泌等机制参与固有免疫应答；同时也可以诱导树突状细胞（DC细胞）分化成熟、T细胞分化，调节特异性免疫应答反应，被认为是连接固有免疫与特异性免疫的关键膜蛋白[19, 20]。其中TLR4是发现最早，也是研究最多的Tolls[21]，其显著的生物学功能是促进细胞因子和趋化因子合成并释放，促进炎症反应。近来，许多研究已证实EGCG在动物体内试验中能下调TLR4表达和（或）抑制其活化，而减少炎症反应[7, 8]。另有研究通过TLR4先天缺陷小鼠与野生型小鼠复制部分肝叶缺血再灌注损伤模型，观察到了TLR4先天缺陷小鼠肝病理形态损害程度明显轻于野生型小鼠，并伴有肝功能（ALT、AST）降低，说明TLR4受体参与了肝脏缺血再灌注伤[22]。另有研究证实TLR4通过与LPS结合，激活TLR4信号通路，活化NF-κB并启动核内相关基因表达，合成TNF-α，IL-1，IL-6等一系列细胞因子和趋化因子并释放到细胞外，引起粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞的趋化聚集[8, 23]，从而引起炎症的“级联瀑布效应”，加重组织细胞的损伤。在我们的研究中，通过免疫组化发现小鼠左外叶肝缺血/再灌注损伤6h后EGCG组较I/R组缺血区及肝窦周围TLR4阳性表达率明显减少，同时，EGCG组较Sham组的缺血区及肝窦周围TLR4阳性表达率显著增多，表明了EGCG对肝脏IRI有保护性作用，并且EGCG能下调TLR4的表达有关，为进一步明确其保护作用机制，我们进一步测定了其下游的NF-κB P65的表达水平。
NF-κB又称为核因子kappa B, 是细胞内基因转录活动的“调节因子”，参与炎症及凋亡相关基因的表达，在真核生物细胞中以异源二聚体的形式存在。目前，我们已发现有P65、P52、P50、Rel B及c-Rel五种不同的亚型[24]。五种亚基间不同的组合方式决定了NF-κB在组织细胞中不同的生物学功能，其中最常见的组合是P65/P50[25]。生理条件下P65/P50复合体与IκB（inhibitor ofκappa B）结合使P65/P50复合体上磷酸化位点处于封闭状态，从而抑制其活化。失去活性的P65/P50复合体不能进入细胞核内促进相关靶基因的转录[25]。当IκB发生磷酸化、泛素化被降解后，P65/P50游离并被磷酸化而激活，从胞浆穿梭到核内与TNF-α、IL-1b等相应靶基因启动子结合促进其转录而介导炎症反应及凋亡，这些表达的细胞因子反过来刺激NF-κB的过表达，由此形成正反馈调节机制，从而引起炎症的“级联瀑布效应”，导致机体免疫炎症反应的过表达，损伤机体组织器官。本实验发现，Sham组NF-κB P65蛋白表达水平很低，而I/R组缺血再灌注损伤肝叶内核蛋白（NF-κB P65）阳性表达率显著上调，在使用EGCG预处理小鼠后缺血/再灌注损伤肝叶内核蛋白（NF-κB P65）阳性表达率较I/R组明显降低，同时其表达量要明显高于Sham组，其表达量与TLR4表达水平相一致。
综上所述，EGCG在肝缺血/再灌注损伤中通过减少肝细胞坏死数量，改善肝功能（ALT、AST水平降低），对肝缺血/再灌注损伤起到保护性作用。并证实了肝缺血/再灌注后缺血再灌注肝中TLR4、NF-κB P65信号分子较Sham组显著高表达，而使用EGCG预处理Balb /c小鼠，肝缺血再灌注6h后TLR4/NF-κB P65信号通路上TLR4、NF-κB P65信号分子均较I/R组明显低表达。因此，本研究表明，TLR4、NF-κB P65信号分子介导了缺血后的肝组织炎症损伤，且EGCG对肝缺血再灌注损伤具有保护作用，其保其保护机制可能与调控TLR4/NF-κB P65信号通路上TLR4、NF-κB P65信号分子表达有关。由此可见，TLR4与NF-κB P65信号分子可能为我们在肝移植、复杂肝切除及严重肝创伤手术等临床过程中防治肝缺血再灌注损伤中作为潜在靶点。

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