【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 表没食子儿茶素没食子酸酯；缺血再灌注；NF-κB P65；TLR4；Balb /c小鼠
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正文：
[摘 要] 目的：探讨表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-Epigallocatechin-3-gallate , EGCG]对Balb/c小鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用。方法：健康雄性Balb /c小鼠18只，随机分3组（n=6），分别为：对照组（Sham组）、缺血再灌注组(I/R组)和I/R+EGCG处理组（EGCG组）。各组分别于再灌注末摘除眼球取血样，处死小鼠收集肝组织。测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平；取缺血再灌注肝叶（左外叶肝）组织行HE染色后光镜下观察其病理形态学改变；免疫组织化学测定TLR4（Toll-like receptor4，TLR4）和 NF-κB P65 (nuclear transcription fator-kappa B P65)蛋白的表达量。结果：经EGCG预处理后，EGCG组小鼠血清AST、ALT的水平明显低于IR组(P<0.05)，而显著高于Sham组(P<0.01)。HE染色结果显示，EGCG组左外叶肝组织损伤程度明显小于IR组，但较Sham组显著增大。免疫组化结果显示，EGCG组TLR4及NF-κB P65蛋白的阳性表达评分分别为（6.67±1.97分，5.67±1.51分）比I/R组（9.00±1.55分，8.33±2.25分）明显降低(P<0.05)，较Sham组（3.00±0.98分，2.83±0.98分）显著升高(P<0.01)。结论：EGCG可减少肝组织缺血再灌注损伤，其机制可能与EGCG下调TLR4/NF-κB P65信号通路表达量有关。
[关键词]  表没食子儿茶素没食子酸酯；缺血再灌注；NF-κB P65；TLR4；Balb /c小鼠
Epigallocatechin-3-gallate-induced protection on liver ischemia-reperfusion injury
Zeng Xianhui, Shen Xiaoyun, Wang Jiangyan, Feng Yan, LUO Xiaoling(Department of Research, Affiliated Cancer Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi China)
[Abstract] Objective: To investigate of Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on liver ischemia-reperfusion injury’s protection effect in vivo. Methods: Eighteen male Balb/c mice were randomly divided into three groups(n=6)：sham-operatec group(Sham group),ischemia-reperfusion group(I/R group) and EGCG group. The mice were sacrificed at the end of reperfusion, and serum levels of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST) were measured. HE staining was used to observe the changes of the hepatic histopathological, and Immunohistochemistry was applyed to examine the expression of NF-κB P65 and TLR4 protein. Results: After the pre-treatment with EGCG, compared with Sham group, I/R group showed significantly increased the serum levels of AST and ALT, the protein level of TLR4 and NF-κB P65 in left lobe of liver tissue, with obvious histopathological changes in liver. EGCG group significantly decreased the elevated the serum levels of AST and ALT and the protein level of TLR4 and NF-κB P65 in left lobe of liver tissue, and lessened hepatic histopathological changes. Conclusion: EGCG can protect hepatic ischemia-reperfusion injury. The mechanism(s) underlying these effects of EGCG may involve the production of inflammatory factors of NF-κB P65 and TLR4 expression.
[Key words] (-)-epigallocatechin-3-gallate; ischemia-reperfusion; nuclear transcription fator-kappa B P65 (NF-κB P65);  toll-like receptor4(TLR4)
肝缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury ,IRI)是目前肝移植、复杂肝切除等临床过程中常涉及到的病理生理过程。随着肝移植和复杂肝叶切除手术的不断开展，如何防治IRI的发生成为广大医疗工作者亟需解决的难题。近年来，因天然植物提取物有成本低，来源广，毒副作用小等优点，采用其防治IRI的发生逐渐成为医学关注的热点。表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-Epigallocatechin-3-gallate, EGCG]是从绿茶中提取出来的一种水溶性成分，具有多种生物活性和药理效应，如抗炎、抗氧化、清除自由基及减轻肝缺血再灌注损伤的作用[1, 2]。由于EGCG对肝缺血再灌注损伤的作用效果及其机制尚不明确，据相关文献报道，EGCG对心脏、肾脏、小肠缺血再灌注损伤有保护作用[3-6]，然而，EGCG对肝脏缺血再灌损伤作用目前报道甚少。另有报道，EGCG能抑制TLR4的表达[7, 8]，减少炎症介质的生成，从而减少炎症反应，发挥对机体组织细胞的保护作用。相关文献报道，TLR4/ NF-κB信号通路在机体内控制炎症介质（如TNF-α，IL-1b 及 IL-6等）的产生，从而起到调节炎症反应[6, 9, 10] 。因此，本研究拟通过EGCG预处理Balb /c小鼠，观察小鼠缺血再灌注肝组织病理形态学改变，测定小鼠血清中ALT、AST的浓度变化，及TLR4和NF-κB P65相关信号分子蛋白表达变化量的变化。以此来探讨EGCG对小鼠肝缺血再灌注损伤的作用效果，为进一步研究EGCG对小鼠肝缺血再灌注损伤的作用机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1  实验动物、主要试剂及仪器设备
健康雄性Balb/c小鼠18只，体重18-22g，购于广西医科大学动物实验中心，EGCG购自美国Sigma公司，纯度≧95%，肝功能检测仪7600-050 automatic analyzer购自日本HITACHI公司，NF-κB P65、TLR4兔抗鼠一抗购于美国abcam公司，即用型SP免疫组化试剂盒及DAB酶底物显色试剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2  实验方法
1.2.1 肝脏I/R动物模型的建立及实验分组
健康Balb/c小鼠18只，随机分成3组，每组6只：对照组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、I/R+EGCG处理组（EGCG组）。Babl/c小鼠左外叶肝缺血再灌注模型（I/R）的建立：小鼠术前12h禁食，自由进水。腹腔注射1%的戊巴比妥50mg/kg麻醉。取上腹正中切口，入腹后采用无创动脉夹阻断左外叶肝蒂，小鼠左外叶肝缺血，30min后移去无创动脉夹，恢复血供6h后摘除小鼠眼球取血并处死小鼠取左外叶肝组织。Sham组仅开腹，游离肝十二指肠韧带，不做I/R处理；EGCG组及I/R组开腹游离肝十二指肠韧带，并用无创动脉夹阻断左外叶肝蒂，造成左外叶缺血。EGCG组于术前26h、14h、2h分别腹腔注射80mol·kg-1EGCG；同样Sham组及I/R组于术前26h、14h、2h分别腹腔注射等量生理盐水。
1.2.2 血清学检测  分别于再灌注末摘除小鼠眼球取血，常温1200r/min离心10min，取血清，用ALT、AST全自动生化仪分别测定ALT、AST值。
1.2.3 肝组织病理学检测 
在光学显微镜下观察左外叶肝组织损伤程度。再灌注6h后处死老鼠切取左外叶肝脏组织，4%的福尔马林液固定，常规石蜡包埋、切片，并HE染色。在光镜（×200）下观察再灌注肝组织的病理形态学变化，并评定肝组织损伤分级，其分级标准[11]：0级，肝小叶、肝细胞、肝细胞索、中央静脉、肝窦均正常；Ⅰ级，个别肝细胞变性，汇管区少量炎细胞聚集；Ⅱ级，肝中央静脉、肝窦内淤血及散在肝细胞变性坏死，肝组织内炎细胞聚集较多，肝小叶结构完整；Ⅲ级，肝中央静脉、肝窦内淤血及广泛肝细胞变性坏死，大量炎细胞聚集，部分肝组织结构破坏不完整。
1.2.4 肝组织免疫组织化学染色
采用免疫组化SP染色法，以0.0l mol／L柠檬酸进行热修复，正常山羊血清封闭后，滴加一抗(抗TLR4、抗NF-κB P65)过夜，余步骤严格遵照试剂盒说明书进行。阳性对照由试剂公司提供，用PBS代替一抗作为阴性对照。以胞膜和(或)胞质和(或)胞核中出现明显的黄色或黄褐色颗粒视为免疫组化染色阳性，综合染色强度及阳性细胞数量进行半定量分析。根据免疫阳性细胞染色程度( A )：无染色为0分；细胞膜或质内见淡黄色颗粒，明显高于背景为1分；较多棕黄色颗粒为2分；大量棕黄色颗粒为3分。每片随机观察5个视野，计数500个细胞中染色阳性细胞数( B )：阳性细胞数<5% 为0分，5%-25% 为1分，26%- 50% 为2分，50%-75%为3分，>75%为4分。A 与B相乘为其最后得分[12]。分析TLR4和NF-κB的表达与EGCG作用的关系。

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