[摘要] 目的探讨Topo-II、P-gp及Ki-67蛋白在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征的关系。方法采用免疫组化法检测80例结直肠癌组织中Topo-II、P-gp和Ki-67的表达情况。结果Topo-II、P-gp和Ki-67在结直肠癌组织中的表达率分别为68.75%(55/80)、41.25%(33/80)及81.25%(65/80)，Topo-II和Ki-67表达呈正相关，P-gp的表达与肿瘤淋巴结转移密切相关。结论联合检测此三项指标为进一步研究结直肠癌多药耐药机制及逆转耐药提供理论依据，对临床判断预后及选择化疗药物具有一定的指导意义。

　　结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居恶性肿瘤前列，术前术后辅助化疗在该肿瘤的治疗中发挥着不可替代的作用，然而肿瘤的多药耐药性(multi-drug resistance，MDR)常导致患者对化疗药物不敏感，终致化疗失败。肿瘤的多药耐药性产生机制十分复杂，常由多基因、多步骤共同作用介导产生，现认为P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)等耐药蛋白的外排泵药、谷胱甘肽及谷胱甘肽转移酶影响药物代谢及拓扑异构酶II(topoisomerase，Topo-II)影响药物靶点等机制是多种肿瘤发生多药耐药的主要机制[1]。本文采用免疫组化法检测80例结直肠癌中P-gp、Topo-II及Ki-67的表达情况，并分析其表达与临床病理参数的相关性，为进一步研究结直肠癌多药耐药及逆转耐药提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料收集江苏大学附属武进医院2015~2016年手术切除的结直肠癌80例，术前均未进行放化疗。其中男性55例，女性25例，年龄42~88岁，平均年龄69.06岁;无浆膜浸润19例，浆膜浸润62例;有淋巴结转移31例，无淋巴结转移49例。

　　1.2试剂与方法鼠抗人Topo-II、P-gp、Ki-67单克隆抗体，SP免疫组化染色及DAB显色试剂盒均购自于福州迈新生物技术有限公司。免疫组化采用SP法，操作步骤参照试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3结果判断

　　Topo-II、Ki-67以细胞核内、P-gp以细胞质或胞膜呈现棕黄色颗粒为阳性。染色强度呈淡黄色为1分;浅棕色为2分;深棕色为3分。阳性细胞百分率10% ~25%为1分;25% ~ 50%为2分;50% ~75%为3分;>75%为4分。两项得分相乘，评分≤4分者为阴性，>4分者为阳性。

　　1.4统计学处理

　　采用SPSS16.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，指标间的相关性检验采用Spearman相关分析。

　　2结果

　　2.1结直肠癌中Topo-II、P-gp及Ki-67的表达

　　Topo-II、 Ki-67阳性棕黄色颗粒定位于细胞核，表达率分别为68.75%、81.25%。P-gp阳性棕黄色颗粒定位于细胞质或胞膜，表达率为41.25%

　　2.2Topo-II、P-gp及Ki-67在结直肠癌中的表达与临床病理特征的关系

　　Topo-II及Ki-67表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度及淋巴结转移均无关，P-gp表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及浸润深度无关，而与淋巴结转移密切相关(P<0.05，表1)。

　　表1 Topo-II、P-gp和Ki-67表达与结直肠癌临床病理特征的关系 临床病理参数 n Topo-II(+)% P P-gp(+)% P Ki-67(+)% P 性别 男 55 39(70.90) 0.537 22(40.00) 0.736 48(87.27) 0.535 女 25 16(64.00) 11(44.00) 23(92.00) 年龄(岁) <60 16 9(56.25) 0.228 5(31.25) 0.364 14(87.50) 0.860 ≥60 64 46(71.88) 28(43.75) 57(89.06) 浸润情况 未达浆膜 18 15(83.33) 0.129 6(33.33) 0.438 17(94.44) 0.385 浆膜及浆膜外 62 40(64.52) 27(43.55) 54(87.10) 淋巴结转移 有 31 24(77.42) 0.183 22(70.97) 0.000 27(87.97) 0.710 无 49 31(63.27) 11(22.45) 44(89.80) 肿瘤大小(cm) <5 69 47(68.12) 0.759 27(39.13) 0.335 61(88.41) 0.807 ≥5 11 8(72.73) 6(54.55) 10(90.91) 2.3结直肠癌中Topo-II、P-gp与Ki-67表达的相关性

　　Topo-II与Ki-67的表达呈正相关(P<0.05)，P-gp与Ki-67表达无相关性(表2)。

　　表2 结直肠癌中Topo-II、P-gp表达与Ki-67表达的关系 Ki-67 Topo-II P P-gp P + - + - + 50 15 0.001 25 30 0.257 - 5 10 8 17 3 讨论

　　MDR是指对多种结构不同、作用靶点不同的抗肿瘤药物同时具有耐药性，是肿瘤细胞免受化疗攻击的最重要的防御机制，也是导致化疗失败的主要原因。MDR主要通过降低细胞内化疗药物的有效蓄积，改变机体内酶活性、含量或分布，改变药物靶点或增强损伤靶点的修复及过度表达抗凋亡基因等途径发挥作用。研究肿瘤MDR发生机制为肿瘤的耐药逆转及化疗药物的选择提供一定的理论依据，从而提高临床化疗效果。 Topo-II是存在于细胞核内的催化DNA双链拓扑异构体相互转化的一种核酶，在DNA的复制、转录，染色体的分离及重组中起着重要作用。某些化疗药物如蒽环类抗生素、鬼臼类毒素等可以Topo-II为靶点与DNA形成稳定的药物-Topo-II-DNA复合物，干扰DNA的复制或使DNA断裂致细胞凋亡，达到抗癌作用[2]。因此肿瘤内Topo-II高表达是此类药物作用的基础，其表达的下调、活性的改变、基因的点突变及发生超磷酸化均可以影响药物-Topo-II-DNA复合物的形成，从而使肿瘤细胞逃脱化疗药物的杀伤，降低该类化疗药物的敏感性而发生耐药。多种肿瘤中Topo-II高表达的病例化疗敏感性优于低表达者，有研究表明：Topo-II表达的高低，可以作为评判各种肿瘤耐药性及化疗敏感性的指标之一[3]。此外，Topo-II常高表达于有丝分裂的S2、G2/M期，此时肿瘤复制加快，细胞增殖能力强。Ki-67是与核糖体RNA转录有关的糖蛋白，在细胞静止期不表达，其他各期均有表达，可以作为细胞增殖的标记。魏等[4]利用免疫组化检测肝癌组织中Topo-II和Ki-67表达情况，发现其二者表达一致。本实验结果与魏等报道一致，80例结直肠癌组织Topo-II和Ki-67的表达具有极强的相关性。本实验中Topo-II表达率为68.75%，且其表达与患者年龄、性别、肿瘤浸润深度及淋巴结转移均无关，说明未经化疗的结直肠癌对以Topo-II为靶点的化疗药物原发耐药率不高，在临床治疗中对Topo-II阳性的患者选用该类药物可能会得到较好的化疗效果。P-gp是mdrl基因编码的跨膜糖蛋白，主要分布于上皮细胞胞膜中，正常组织中表达量很低，可以利用水解ATP产生的能量主动将抗肿瘤药物泵出细胞，降低细胞内化疗药物的浓度，从而降低药物的毒性，P-gp高表达往往提示肿瘤对化疗药物不敏感。Kirtane等[5]认为P-gp高表达导致的原发性耐药是结直肠癌化疗失败的主要原因之一，郭颖等[6]认为P-gp高表达与肿瘤的浸润深度及淋巴结转移密切相关，随着浸润深度增加、淋巴结转移增多，P-gp阳性表达率增高。本研究显示P-gp在结直肠癌中存在过表达，阳性表达率为41.25%，有淋巴结转移者表达明显增高，提示P-gp可能与结直肠癌耐药及淋巴结转移有关，对评估结直肠癌临床化疗用药及淋巴结转移有重要的意义。

　　总之，Topo-II和P-gp在结直肠癌多药耐药发生中均发挥着重要的作用，通过对以上二者的测定，初步判断患者的耐药机制，为临床制定最佳化疗方案提供一定的理论依据，同时为我们进一步研究结直肠癌多药耐药的靶点治疗及耐药逆转提供更全面的实验室依据。

　　参考文献

　　[1] Kunjachan S, Rychlik B, Storm G, et al. Multidrug resistance: Physiological principles and nanomedical solutions[J]. Adv Drug Deliv Rev 2013,65(13-14) : 1852-1865.

　　[2] Chikamori K, Grozav AG, Kozuki T,et al. DNA topoisomerase II enzymes as molecular targets for cancer chemotherapy[J]. CurrCancerDrugTargets.2010, 10(7):758-771.

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