【分　 类】 化工与理学
【关 键 词】 绵羊；捻转血矛线虫；Hc38；pcDNA3.1；DNA 疫苗
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正文：

M．RNA分子量标准；      1、2  分别为重组质粒免疫注射部位肌肉提取的总RNA
M．The RiboRuler™ High Range RNA Ladder；     1 、2  Total  RNA  of  muscle of  injection  sites  respectively   
图3 总RNA提取电泳结果
Fig.3  Total  RNA
 

M. 100bpDNA 分子量标准 ；   1、3 分别为 pcDNA3.1 免疫组注射部位肌肉；2、4分别为pcDNA3.1-Hc38免疫组注射部位肌肉
M. 100bpDNA ladder marker ； 1、3   negative controls ；  2、4  muscle of pcDNA 3.1-Hc38 of  injection  sites  respectively
图 4  RT-PCR 检测DNA 疫苗的转录
Fig. 4 Detection the transcriptions of DNA vaccine by RT-PCR
2.4  Western blotting检测  重组质粒第2次免疫后8d，采羊血清检测重组Hc38抗原，在约17KD处出现明显的印迹条带（图5）,大小与Hc38保守区的理论值一致。

M．蛋白质分子量标准；1.pPROEXHTa表达产物；2.pPROEXHTa-Hc38诱导表达包涵体的纯化产物；3.羊血清与Hc38蛋白免疫印迹
M. protein molecular mass marker；    1.SDS-PAGE of expression product inclusion from pPROEXHTa；      2.SDS-PAGE of purfied expression product from pPROEXHTa-Hc38；     3.Western blotting was probed to Hc38 expression purfied product with sheep serum
图5  Western Blotting 检测DNA疫苗的表达
Fig. 5  Detection the expression of DNA vaccines by Western Blotting
2.5  ELISA检测血清抗体  第1次免疫后9d抗体滴度达到较高水平，然后急剧下降；在第2次免疫后4d，抗体开始迅速升高，第2次免疫后10d，达到较高点，然后发现抗体滴度下降到较低水平后开始回升，并维持在一个较高水平。同时发现5号羊抗体水平最高，9号羊抗体变化幅度最大，4号和7号抗体也能维持在较高水平。以下是疫苗免疫后，抗体消长曲线（图6、图7）。

图6  抗体变化规律
Fig.6  Dynamics of sheep anti-Hc38 antibody

图7  免疫组总体抗体变化规律
Fig.7  Dynamics of  sheep anti-Hc38 antibody in overall immunity group
2.6  虫卵计数  攻虫后第21天，粪便中开始能检测到少量的捻转血矛线虫虫卵，随着时间推移，对照组和核酸疫苗免疫组每克粪便虫卵数（EPG）逐渐增加（如图8、图9）。
 
图8  虫卵排出数变化规律
Fig.8   Dynamics of eggs shedding

图9  免疫组总体虫卵排出数变化规律
Fig.9  Dynamics of eggs shedding in overall immunity group
2.7 成虫减少率  感染捻转血矛线虫L3后33d，剖检羊第四胃，收集成虫，按雌雄虫分别计数。对照组平均每只羊的雌虫、雄虫、成虫荷虫数分别为500、450、950，而核酸疫苗免疫组分别为345.3、290.6、635.9（表2）。免疫组与对照组相比，雌虫减少31%、雄虫减少36%、成虫减少33.1%。
表 2 羊胃内捻转血矛线虫成虫计数
Table 2   Abomasal worm burdens

分组 Group	雌虫 Female worms	雄虫 Male worms	总数 Total worms	雌雄比 Female/male	成虫减少率（%） Reduction in worm burdens
对照组 Control	500±87.5	450±50	950±137.5	1.11	——
实验组 Experimental	345.3±60.3	290.6±56.3	635.9±104.9	1.19	33.1

3 讨 论
本文通过绵羊免疫保护性试验发现，捻转血矛线虫Hc38保守结构域DNA疫苗具有一定的保护作用，该DNA疫苗使绵羊虫卵排出数、成虫荷虫量分别减少了66.6%、33.1%，虫卵孵化率低于5%。核酸疫苗表达的抗原蛋白在动物体内能够得到较好的表达，从而诱导产生较全面的免疫应答反应。在抗捻转血矛线虫免疫中，Th2型T细胞处于重要的地位^[17]，但与寄生部位局部黏膜的T、B 细胞免疫应答、特异性IgA、IgE、IgG1 等抗体的产生、嗜酸性粒细胞和肥大细胞的浸润也密切相关，这些免疫细胞和免疫因子在“快速排斥反应”和“迟发性排斥反应”中变化尤其明显^[18,19]。研究表明，DNA 疫苗不仅能引起体液免疫应答，而且可以诱导机体产生细胞免疫应答，尤其可诱导在抗线虫免疫中发挥重要作用的CTL应答反应。本研究发现，该基因DNA疫苗第2次免疫后，5号羊静脉注射方式产生的抗体较高，虫卵数和成虫数也较低；同时8号羊抗体不是最高，虫卵数也较低，这说明在抗捻转血矛线虫免疫中，不仅仅是抗体发挥保护作用，这可能是DNA疫苗免疫效果优于重组蛋白的另外一个原因。已有的研究表明，将IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN-γ、GM-CSF等作为基因佐剂用于DNA免疫，极大的增强了核酸疫苗的免疫原性，抗体水平、CTL、DTH等显著提高，提高了免疫效果^[20~22]。将重组细胞因子与该DNA疫苗联合应用或将细胞因子基因与Hc38基因融合表达构建免疫调节型DNA疫苗，或将捻转血矛线虫Hc38抗原与其它抗原联合使用，制成多价基因疫苗也可能是提高免疫保护的另外一种策略。同时，实验发现8号注射较大剂量疫苗对虫卵数有较好的抑制作用；9号注射脂质体佐剂的绵羊成虫数最少。本实验证明肌肉注射和联合注射免疫途径能产生较高的抗体水平，和Fynan等^[23]不同免疫途径的保护效果相符。因此，进一步优化免疫途径、免疫剂量和免疫途径将有利于提高疫苗的免疫保护效果。
本研究通过Hc38基因保守结构域的绵羊免疫保护性试验，证实了捻转血矛线虫Hc38 DNA疫苗具有一定免疫保护作用，这为研发新型捻转血矛线虫疫苗提供了新思路，为解决目前尚无有效疫苗现状提供了可能。迄今为止，DNA疫苗的免疫保护效果有待进一步提高，其免疫保护作用机理有待深入探讨。

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