【分　 类】 化工与理学
【关 键 词】 绵羊；捻转血矛线虫；Hc38；pcDNA3.1；DNA 疫苗
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正文：

1.6 绵羊免疫保护性试验
1.6.1 动物分组 选择体重相当、驱虫后检测无捻转血矛线虫、5～7月龄健康绵羊10只，随机分成2组；对照组为1号和2号，实验组为第3～10号；首免和二免间隔2 w。第2次免疫后14d，每只绵羊感染10000只捻转血矛线虫第三期幼虫（L3）。免疫途径、方式和剂量如表1所示；脂质体佐剂的制备方法参考文献^[14]。
表1 实验动物分组及免疫情况
Table 1  Detailed information about every group and immunization

No	首免途径及剂量 First immunization	二次免疫途径及剂量 Boosting
1	无	无
2	肌肉多点注射pcDNA3.1质粒600ug	肌肉多点注射pcDNA3.1质粒600ug
3	肌肉多点注射重组质粒600ug	无
4	肌肉多点注射重组质粒600ug	肌肉多点注射重组质粒600ug
5	静脉注射重组质粒600ug	静脉注射重组质粒600ug
6	涎腺注射重组质粒600ug	涎腺注射重组质粒600ug
7	多途径（肌肉、静脉、皮下）注射重组质粒600ug	多途径（肌肉、静脉、皮下）注射重组质粒600ug
8	肌肉多点注射重组质粒1500ug	肌肉多点注射重组质粒1500ug
9	脂质体重组质粒肌肉多点注射600ug	脂质体重组质粒肌肉多点注射600ug
10	肌肉多点注射GenEscort150ul+重组质粒600ug	肌肉多点注射重组质粒600ug

1.6.2 Western Blotting检测DNA疫苗的翻译  以pPROEXHTa-Hc38原核表达蛋白制样、SDS-PAGE、电转移至硝酸纤维膜后，以核酸疫苗第2次免疫后2w绵羊血清为一抗、兔抗羊IgG-HRP为标记二抗进行免疫印迹。
1.6.3 ELISA检测抗体水平 于第1次免疫后9 d、第2次免疫后4、10、18、24、52d采血分离血清，l﹕50 稀释后按常规方法操作^[15]。
1.6.4 虫卵计数 采用麦克马斯特氏法^[16]。捻转血矛线虫L3感染后，分别于第21、23、25、27、29、31、33 天羊直肠采集粪便，用于虫卵计数。
1.6.5 成虫计数 感染L3后第33 d，颈动脉放血致死绵羊，收集第四胃，分离捻转血矛线虫，分别计数雌雄虫数目。
2  结  果
2.1  DNA 疫苗的构建及鉴定
2.1.1 通过质粒PCR扩增，电泳得到约450bp的扩增产物，与预期结果相符（图1）。

M.DL2000 DNA 分子量标准；  1.阴性对照 ； 2.Hc38保守结构域所在基因片段扩增产物
M.DL2000 DNA  ladder marker ；  1..negative control ； 2.PCR products of Hc38gen of conserved domain in fragment
图1  Hc38保守结构域所在基因片段PCR产物电泳结果
Fig.1 Agarose gel electrophoresis PCR products of Hc38 gene of conserved domain in fragment
2.1.2  重组质粒双酶切鉴定，电泳得到约为442bp和5348bp的条带(图2)，与预期结果相符。                                                                                                                                                                

  M. 100bpDNA 分子量标准 ；     1/2. 重组质粒pcDNA-Hc38经Hind Ⅲ 和 Xba I 双酶切后的产物
M. 100bpDNA ladder marker ；  1/2. Recombinant Plasmid  digested with Hind Ш and XbaⅠof pcDNA3.1-Hc38
图2  重组质粒pcDNA3.1-Hc38的双酶切电泳结果
Fig.2  Double enzyme digestion of Recombinant Plasmid pcDNA-Hc38
2.2  DNA疫苗的制备与纯化  多次大量提取质粒并纯化后，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀的值均在1.8～2.0范围内，达到了疫苗注射的要求，并肌肉多点注射小鼠200ug后未见明显不良反应。
2.3  RT-PCR检测  重组质粒免疫后8d，在小鼠注射部位的肌肉中检测到Hc38基因的转录，而对照组无相应的扩增（图3、图4）。
                

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