对比图1、图2可知，柔性载体在1629cm-1出现了氨基与醛基反应形成的希夫碱(Schiff base)的C=N吸收峰，因此判断双醛淀粉中的醛基与载体氨基结合形成了西佛碱。

　　2.2各因素影响柔性固定化酶制备的试验结果

　　2.2.1 DAS用量对固定化酶活力回收率的影响

　　根据经验，在其它条件不变(固定化温度20℃、pH 8.0、固定化时间20h、酶加量30mg/g壳聚糖)，考察DAS用量对固定化酶活力、回收率的影响，试验结果见表1。

　　表1 DAS用量对固定化酶活力、回收率的影响实验数据

　　Tab1 Effect of the energy of immobilized enzymesand percent recovery on DAS dosage DAS用量mg/g 0.4 0.8 1.0 1.2 游离酶 酶解液 0.743 0.883 0.909 0.714 空白液 0.188 0.224 0.267 0.172 柔性固定化酶 酶解液 1.635 空白液 0.205 m1 0.5 0.5 0.5 0.5 m2 10.19 10.22 10.31 10.43 游离酶活(万U/g) 151.94 固定化酶酶活

　　(U/g(壳聚糖)) 70.21 82.32 80.27 75.64 酶活回收率/% 44.62 54.18 52.82 49.78 从试验结果可知，DAS用量为0.8mg/g壳聚糖最适。当DAS用量较少时，酶活回收率偏低，随着DAS用量的增加，酶活回收率逐渐升高，当DAS与壳聚糖比例超过0.32:1时，酶活回收率基本保持不变。这可能由于当DAS的用量较少时，同一柔性链上的多个醛基可能同时和载体上的多个氨基发生多重反应，这样所得到的载体上只能结合少量的柔性链且柔性下降，致使酶活回收率偏低。而当DAS的用量增加时，载体上可以结合更多的柔性链，致使载体的柔性及活性醛基量都增加，因此酶活回收率提高。但当DAS用量进一步增加时，因受到载体表面位阻的限制，DAS又是一高分子物质，其在载体表面的担载量会达到一定的饱和度，被固定的酶量不再随DAS的用量增加而增加，故酶活回收率趋于恒定。

　　2.3 固定化温度对固定化酶活力回收率的影响

　　在其它条件不变(pH8.0、固定化时间20h、DAS用量为0.8mg/g壳聚糖、酶加量30mg/g壳聚糖)，考察固定化温度对固定化酶活力及回收率的影响，试验结果见表2。

　　表2 固定化温度对固定化酶活力及回收率的影响实验数据

　　Tab2 Effect of energy of immobilized enzymesand percent recovery on temperature 固定化温度/℃ 20 25 30 游离酶 酶解液 0.744 0.875 0.793 空白液 0.208 0.226 0.215 柔性固定化酶 酶解液 1.579 空白液 0.215 m1 0.5 0.5 0.5 m2 10.25 10.71 10.71 游离酶活(万U/g) 144.93 固定化酶酶活

　　(U/g(壳聚糖)) 67.41 78.11 69.57 酶活回收率/% 46.51 53.90 48.00 由试验结果可知，固定化温度为25℃最佳，当固定化温度较低或过高时，酶活回收率偏低，这是由于固定化温度低时，载体上的醛基不活泼，不利于反应进行;而固定化温度高时，由于游离酶的热稳定性较差，而且固定化的时间较长，一部分的酶被固定于载体上之前已经失活。

　　pH值对固定化酶活力回收率的影响 在其它条件不变(DAS用量0.8 /g壳聚糖、固定化温度为25℃、固定化时间20h、酶加量30mg/g壳聚糖)，考察pH对固定化酶活、回收率的影响，试验结果见表3。

　　表3 pH值对固定化酶活力及回收率的影响

　　Tab3 Effect of energy of immobilized enzymesand percent recovery on pH value pH 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 游离酶 酶解液 0.813 0.823 0.85 0.943 0.874 空白液 0.301 0.276 0.245 0.251 0.265 柔性固定化酶 酶解液 1.628 空白液 0.241 m1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 m2 10.78 10.62 10.71 10.72 10.26 游离酶活(万U/g) 147.37 固定化酶酶活

　　(U/g) 61.22 66.40 72.82 83.21 76.51 酶活回收率/% 41.54 45.05 49.41 56.46 51.92

　　试验结果表明固定化过程在pH为8的偏碱性条件下效果最好。这是因为酶的稳定性较差，当pH值较高或较低时，一部分的酶被固定于载体上之前已经失活，致使酶活回收率较低。

　　2.5固定化时间对固定化酶活力回收率的影响

　　在其它条件不变(DAS用量0.8 /g壳聚糖、固定化温度为25℃、酶加量30mg/g壳聚糖、pH8.0)，考察固定化时间对固定化酶活力及回收率的影响，试验结果见表4。

　　表4固定化时间对固定化酶活力及回收率的影响实验数据

　　Tab4 Effect of energy of immobilized enzymesand percent recovery on time 固定化时间(C)/h 10 20 30 游离酶 酶解液 0.721 0.872 0.649 空白液 0.195 0.241 0.227 柔性固定化酶 酶解液 1.512 空白液 0.204 m1 0.5 0.5 0.5 m2 10.42 10.31 10.69 游离酶活(万U/g) 138.98 固定化酶酶活

　　(U/g(壳聚糖)) 65.07 78.89 50.89 酶活回收率/% 46.82 56.77 36.61 随着固定化时间的延长，酶活回收率先上升，而后下降。原因为：在试验初期，酶不断被固化，提高了酶活回收率。当固定化时间超过20h后，一方面因为载体表面所担载的酶过量，造成位阻效应，另一方面由于柔性固定化酶质地较脆，经长时间的实验容易碎裂。

　　2.6酶加量对酶活力回收率的影响

　　在其它条件不变(DAS用量0.8 /g壳聚糖、固定化温度为25℃、pH8.0、固定化时间20h)，考察酶加量对固定化酶活力及回收率的影响，试验结果见表5。

　　表5酶加量对酶活力及回收率的影响

　　Tab5 Effect of energy of enzymesand percent recovery on enzyme dosage 酶加量 mg/g 20 30 40 50 游离酶 酶解液 0.462 0.772 1.013 0.943 空白液 0.181 0.209 0.274 0.267 柔性固定化酶 酶解液 1.512 空白液 0.204 m1 0.5 0.5 0.5 0.5 m2 10.51 10.51 10.82 10.67 游离酶活(万U/g) 138.98 固定化酶酶活

　　(U/g(壳聚糖)) 34.46 69.05 88.04 81.67 酶活回收率/% 24.80 49.69 63.35 58.76 如表5所示，当每1g载体所用酶量为40 mg/g壳聚糖时，固定化酶的活力回收最多，继续增加酶量，一方面因为双醛淀粉上醛基有限，另一方面由于酶越集中，空间位阻影响也就越大，而且底物与产物也来不及扩散，所以酶的活力回收反而下降。

　　2.7固定化酶的使用批次

　　选用Chitosan-DAS柔性载体，对木瓜蛋白酶进行柔性固定化，规定在37℃下60 min转化一定量酪蛋白液为1个使用批次，并考察此固定化酶的使用批次，试验结果见表6

　　表6柔性固定化木瓜蛋白酶的使用批次

　　Tab6 Papain activity of batches 批次 1 2 3 4 5 6 7 相对活性% 100 94.8 91.5 76.1 66.5 56.2 48.7 由表6可见，固定化酶使用6～7批次后仍保留有原固定化酶活力的一半。

　　2.8柔性固定化酶制备波纹巴非蛤小分子肽试验结果

　　将该柔性固定化酶在酶解温度为40℃，pH为7.0，加酶量为1.0%，酶解时间为4h的条件下进行酶解制备小分子肽，试验结果见表7。

　　表7 酶法制备小分子肽实验结果

　　Tab7 Result of small molecular peptideprepared by enzyme 滤液中蛋白质含量% 3.9375 滤液中游离氨基酸含量% 0.532% 波纹巴非蛤小分子肽产率% 3.4055 3.结论

　　以Chitosan-DAS为柔性载体，对木瓜蛋白酶进行柔性固定化，利用该柔性固定化酶进行酶解波纹巴非蛤软体部分制备小分子肽。实验结果显示，柔性固定化酶温度为25℃，柔性固定化酶时间为20h，加酶量为40mg/g壳聚糖，pH为8.0的柔性固定化条件下所得的固定化酶酶活最高，酶活回收率63.35%;利用柔性固定化木瓜蛋白酶酶解波纹巴非蛤制备小分子肽，产率为3.4055%。

　　参考文献

　　[1] 陈慧萍，吴文言.海洋肤类活性物质的研究概况.海洋科学[J]. 2001，25(11):25一31

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