摘要：本试验以鲫鱼蛋白为底物,利用碱性蛋白酶酶解鲫鱼制备肽,分别以底物浓度、加酶量、温度、pH值为指标应用响应面法优化最佳制备肽工艺，碱性蛋白酶酶解鲫鱼蛋白的技术参数为加酶量1.54%，底物浓度1.3%，温度46.6℃，pH9.4，肽得率最高为32.034%。通过真空冷冻干燥机制成干粉研究其抗氧化性，结果表明鲫鱼小分子肽对DPPH自由基有清除效果，在浓度为1g/L时清除作用能达到60%，但其清除能力不如Vc;鲫鱼小分子肽对超氧阴离子自由基(O2·)的清除效果要好于其对DPPH自由基有清除效果，在质量浓度为1g/L时清除作用能达到83%，其抗超氧阴离子自由基的能力接近于Vc，是一种良好的抗氧化剂。

　　关键词：鲫鱼 肽 抗氧化

　　我国淡水养殖业发达，2001年淡水养殖产量约占世界淡水养殖产量的70%[1]。作为我国非常具竞争优势的产业[2]，的淡水养殖业出口相对于其它农产品比重大，其中广东一省水产品出口总额达到了7.8亿美元[3] 。但我国水产品也出现了一些问题，比如产品综合加工、综合利用率低没有形成产业化，附加值不高，而且品种规模单一 [4]，因此,积极开展淡水鱼,特别是低值淡水鱼的深加工势在必行[5]，发展水产品深加工技术已是当务之急[6]。鲫鱼的经济价值为我国重要食用鱼类之一。肉质细嫩，肉味甜美，营养价值很高，每百克肉含蛋白质13克、脂肪11克，并含有大量的钙、磷、铁等矿物质。

　　本试验以以鲫鱼蛋白为底物,利用碱性蛋白酶酶解鲫鱼制备肽并验证其抗氧化性。

　　1材料与方法

　　1.1材料 新鲜鲫鱼;碱性蛋白酶、

　　1.2仪器 PHS-3S型数字酸度pH计;722型可见分光光度计;78-1磁力加热搅拌器;真空冷冻干燥机

　　1.3方法

　　1.3.1酶解液中可溶性蛋白质的测定

　　双缩脲法测定可溶性蛋白质[7]。双缩脲试剂中NaOH溶液(双缩脲试剂A)的浓度为0.1g/ml，CuSO4溶液(双缩脲试剂B)的浓度为0.01g/ml。

　　标准蛋白质溶液：采用标准的牛血清清蛋白(BSA)，配制成10g/L的标准蛋白溶液，净OD值在540nm比色下绘制标准曲线。并进行空白试验做对照。

1.3.2鲫鱼蛋白溶解度的测定

　　分散指数(PDI)法表示为：

　　C：测定蛋白质的浓度，根据BSA标准曲线测出 ;V：测定蛋白质溶液的总体积，mL; W：蛋白质样品的质量，g。

1.3.3多肽含量的测定[8]

　　用多肽含量(TCA-SN)指数法，表示为：

　　C：滤液中蛋白质的浓度，mg/mL;V：三氯乙酸的加入体积，mL;W：蛋白质样品的质量，g。

　　1.3.4 鲫鱼小分子肽清除DPPH自由基能力的测定

　　鲫鱼小分子肽清除DPPH自由基能力的测定，用无水乙醇配制2×10-4mol/L的DPPH溶液，棕色瓶避光低温保存。分别吸取2mL不同质量浓度鲫鱼小分子肽于试管中，加入2mL所配制的DPPH溶液，摇匀，在25℃水浴反应30min后，在517nm处测定其吸光度值A1，(采用2mL鲫鱼水解分离肽、2mL无水乙醇25℃水浴反应30min为样液本底的吸光度值、2mLDPPH 溶液2mL蒸馏水25℃水浴反应30min为试剂空白的吸光度值)。鲫鱼小分子肽对DPPH自由基的清除率公式如下：

　　(A1 为样液的吸光度值;A2 为样液本底的吸光度值;A3 为试剂空白的吸光度值)

　　1.3.5 鲫鱼小分子肽清除超氧阴离子自由基(O2·)能力的测定

　　鲫鱼小分子肽清除超氧阴离子自由基(O2·)能力的测定，吸取邻苯三酚0.1mL于试管中，加入pH值8.2的Tris-HCl缓冲溶液5mL，加入不同质量浓度的鲫鱼水解多肽0.25mL，迅速混匀，在25℃水浴保温15min后，以蒸馏水做空白对照，在320nm处时测吸光度A1 ，并测定扣除鲫鱼小分子肽和本底自身的干扰，鲫鱼小分子肽对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下：

　　(A1 为样液的吸光度值;A2 为试剂空白的吸光度值; A3 为样液本底的吸光度值)

　　2结果与分析

　　2.1碱性蛋白酶酶解鲫鱼响应面优化工艺

　　响应面法对因素和水平的组合具有广泛的应用，尤其是研究多因素和多水平问题的必不可少工具，在食品工业中应用比较广泛，本试验在完整的大量的单因素试验结果基础上，对加酶量、底物浓度、温度和pH值影响碱性蛋白酶酶解反应的因素，使用SAS8.1编码设计了4因素3水平的中心组合，其结果如下表1、2。

　　表1 碱性蛋白酶Box-Behnken设计试验因素水平及其编码表

　　Table 1 Alkaline protease level of experimental factors BBD design andcoding table 因素 编码值 水平 -1 0 1 加酶量 X1 1.00% 1.50% 2.00% 底物浓度(%) X2 1.00 1.50 2.00 温度(℃) X3 40 45 50 pH值 X4 9 9.5 10

　　表2 碱性蛋白酶Box-Behnken设计试验及结果

　　Table2 Alkaline protease BBD design testing and results 试验号 X1加酶量E/S(%) X2底物浓度(%) X3温度(℃) X4pH值 TCA-SN(%) 1 -1 -1 0 0 42.3 2 -1 1 0 0 27.6 3 1 -1 0 0 35.6 4 1 1 0 0 28.4 5 0 0 -1 -1 29.6 6 0 0 -1 1 28.9 7 0 0 1 -1 29.4 8 0 0 1 1 32.7 9 -1 0 0 -1 34.9 10 -1 0 0 1 32.8 11 1 0 0 -1 45.7 12 1 0 0 1 36.7 13 0 -1 -1 0 31.6 14 0 -1 1 0 34.8 15 0 1 -1 0 28.9 16 0 1 1 0 28.3 17 -1 0 -1 0 35.8 18 -1 0 1 0 29.4 19 1 0 -1 0 32.8 20 1 0 1 0 32.9 21 0 -1 0 -1 36.8 22 0 -1 0 1 31.9 23 0 1 0 -1 28.6 24 0 1 0 1 26.7 25 0 0 0 0 48.3 26 0 0 0 0 47.6 27 0 0 0 0 49.7

　　2.2各种因素对多肽含量(TCA-SN)的影响

　　用响应面软件分析，以多肽含量(TCA-SN)为指标，鉴定各因素对水解度的影响，所得回归方程如下：

　　YTCA-SN =2.46 + 0.538333×X1 - 2.111667×X2 - 0.133333×X3 - 0.748333×X4- 1.604167×X12 - 0.0075×X1×X2 + 1.17×X1×X3 - 0.2275×X1×X4 - 4.439167×X22- 0.5725×X2×X3 + 0.75×X2×X4 - 3.999167×X32 + 0.6325×X3×X4 - 2.764167×X42

　　表3 碱性蛋白酶TCA-SN方差分析表 Table3 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model of Alkaline Protease 方差来源

　　Source 自由度DF 平方和SS 均方MS F值F P值Pr > F 显著性 X1 1 3.477633 3.477633 0.8549 0.37339 X2 1 53.50963 53.50963 13.15417 0.003471 ** X3 1 0.213333 0.213333 0.052443 0.822721 X4 1 6.720033 6.720033 1.651973 0.222943 X1X1 1 13.72454 13.72454 3.373877 0.091118 X1X2 1 0.000225 0.000225 0.000055 0.994188 X1X3 1 5.4756 5.4756 1.346056 0.268531 X1X4 1 0.207025 0.207025 0.050893 0.825314 X2X2 1 105.0997 105.0997 25.83647 0.000269 ** X2X3 1 1.311025 1.311025 0.322287 0.580703 X2X4 1 2.25 2.25 0.553113 0.47136 X3X3 1 85.29778 85.29778 20.96859 0.000633 ** X3X4 1 1.600225 1.600225 0.39338 0.542278 X4X4 1 40.74996 40.74996 10.01748 0.008144 ** 模型 14 223.3918 15.95656 3.92257 0.011412 * 误差 12 48.8146 4.067883 总和 26 272.2064 *表示在α=0.05水平上显著;**表示在α=0.01水平上极显著

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