【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 自身免疫性糖尿病；TSPAN33；B淋巴细胞
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正文：
[摘要]目的 多次小剂量注射链脲佐菌素(STZ)诱导的ICR小鼠糖尿病模型，并探讨诱导ICR小鼠糖尿病模型以及临床T1DM病人样本外周血中B淋巴细胞表面TSPAN33表达的差异。方法 采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导ICR小鼠糖尿病作为动物模型。检测糖尿病模型组体与正常组体重和血糖的情况。用ELISA 检测糖尿病模型组与正常组小鼠血清中胰岛素抗体的水平。流式细胞仪检测外周血B细胞表面TSPAN33表达情况。结果 STZ诱导的糖尿病模型组体重明显减轻，血糖含量有显著的升高（P<0.05）；糖尿病诱导模型组血清中胰岛素自身抗体(IAA)含量明显高于正常组(P<0.05)；STZ诱导的小鼠模型外周血B细胞表达的TSPAN33高于正常鼠；T1DM患者外周血中B细胞表达TSPAN33高于健康对照者。结论 TSPAN33在STZ诱导的自身免疫性糖尿病小鼠和临床T1DM病人的B淋巴细胞的表达均有所上升。
关键词：自身免疫性糖尿病；TSPAN33；B淋巴细胞
[中图分类号] R587.12   [文献标识码] A
 
Diabetic mode of ICR mice established by low dose STZ-induced and T1DM clinical patients expression of B-cell TSPAN33
QIN Man, XU Qin, WANG Ping, TANG Qian, SUN Jingru, WEI Wei, HUANG Baojun
Department of Immunology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
Second people's Hospital of Anhui, Hefei 4483282, China
 
[Abstract] Object: To establish diabetic mode of ICR mice by low dose STZ-induced, and study diabetic mode of ICR mice and T1DM clinical patients expression of B-cell TSPAN33. Methods: The diabetic mode of ICR mice was established by intraperitoneal injection of STZ. The body weight and blood glucose of diabetic model group and normal group were detected. The antibodies level of insulin in serum was detected by ELISA. The flow cytometry was used to detect TSPAN33 on the surface of B lymphocyte in peripheral blood. Results: In the diabetic mode of ICR mice, the body weight was reduced Significantly (p<0.05) while the blood glucose was increased significantly (p<0.05); The antibodies level of insulin and the expression of TSPAN33 of diabetic mode of ICR mice were higher than those of normal group (p<0.05); The expression of TSPAN33 in T1DM patients was higher than that of healthy controls. Result: The expression of TSPAN33 on the surface of B lymphocyte both in the autoimmune diabetes mice induced by STZ and T1DM patients was upgraded compared with controls.
Key words: T1DM; TSPAN33; B lymphocyte
 
1型自身免疫性糖尿病（T1DM)患者的胰腺组织中有大量淋巴细胞浸润，T细胞作为自身免疫病发生的主要细胞，在T1DM发病过程中也起着主要的作用。而越来越多的研究表明B细胞在自身免疫病中也起着十分重要的作用，最近有文献报道，在恶性活化的B细胞膜表面发现了一种新型的标志物TSPAN33[1]。有证据表明T1DM可能增加淋巴瘤发病的风险等，同时糖尿病病人并发肾母细胞瘤和淋巴瘤的风险也会大大增加，而淋巴瘤患者体内出现大量表达的TSPAN33的恶性B细胞的增殖[2,3]。这些证据显示TSPAN33在自身免疫性糖尿病的发生中起着重要作用。在许多自身免疫性疾病如SLE和类风湿关节炎小鼠模型中发现，其外周血中的B细胞表面表达的TSPAN33高于正常水平[1]，在自身免疫性糖尿病模型中，TSPAN33在B淋巴细胞上的表达情况还不清楚。
 
材料和方法
材料
实验动物以及样本
ICR小鼠(4-6周龄)，体重16-20 g, 购自第四军医大学，模型组共24只，雄性12只，雌性12只；对照组共12只，雄性6只，雌性6只。T1DM患者血来自安徽省第二人民医院检验科。
主要试剂 
试剂与仪器　STZ购自德国Merck公司，枸橼酸缓冲液，胰岛素注射液购自上海第一生化药业有限公司，TSPAN33抗体购自美国Santa cruz, HRP标记的驴抗羊二抗和HRP标记的羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司。
方法
STZ诱导小鼠1型糖尿病模型的建立
模型组小鼠连续5天腹腔注射6mg/ml的STZ(用枸橼酸缓冲液稀释)，0.2ml/只；对照组小鼠连续5天腹腔注射等量的枸橼酸缓冲液。注射后每周检测其体重和血糖水平。
血清中胰岛素自身抗体(IAA)的测定
将诱导3-5周的ICR小鼠剪尾取血并分离血清，用ELISA法(间接法)测定血清中IAA的含量。用PBS稀释胰岛素液(5μg/ml)，以每孔100μl包被，4℃过夜，弃包被液，每孔加200μl 1%BSA 37℃封闭2小时，PBST洗3遍，每孔加50μl待检血清，在37℃孵育2小时，用PBST洗涤3遍，每孔加入100μl酶标抗体37℃孵育1小时，用 0.1% PBST洗液洗3遍，每孔加100μl的TMB-底物缓冲液显色,室温避光反应5-10分钟，用酶标仪测OD490值。
STZ诱导小鼠外周血流式细胞检测
取造模成功14天的模型组和对照组小鼠，眼球取血，用Tris-NH4Cl法破除红细胞，再加入FITC-抗人CD19室温下共同孵育20min，用PBS洗涤PBMC三次，加入TSPAN33一抗混匀孵育30min，PBS洗涤3次后，加入FITC标记的驴抗羊二抗4℃孵育3min，PBS洗涤后流式细胞仪检测。
临床诊断T1DM病人外周血流式细胞检测
选取临床诊断为T1DM患者外周血16例，健康体检者21例，分别用Tris-NH4Cl法去除红细胞后，进行流式细胞仪检测，操作同上。
检验方法
使用spss17.0统计软件，两独立样本采用student's t-test，P<0.05认为差异具有统计学意义。
结果
2.1 STZ诱导小鼠模型评估
STZ诱导模型鼠体重和血糖
以推荐的小剂量STZ溶液注射ICR小鼠方式诱导糖尿病模型，每五天检测一次模型鼠的体重和血糖含量。注射后第15天以后开始出现明显的差异P<0.0001(图1A)，STZ组体重较正常组增长明显减少；正常组的血糖含量维持在100mg/ml水平，STZ诱导组到第三周以后也出现明显的上升（图1B）。小剂量STZ成功诱导ICR小鼠的糖尿病模型发生。
 
图1. STZ诱导糖尿病鼠的体重和血糖检测
2.1.2 ELISA检测血清中胰岛素以及其抗体含量
通过ELISA检测，STZ诱导组血清中的中胰岛素在进食前后均明显小于对照组（P<0.0001），而对胰岛素抗体（IAA）的检测发现，STZ诱导后第3天开始，实验组血清中产生更高的抗体浓度，第9天时达到最大水平（P<0.05）。结果表明在STZ诱导的ICR小鼠糖尿病模型为自身免疫性糖尿病模型。
 
 
图2. STZ诱导糖尿病鼠血清胰岛素及其抗体的检测
2.2 STZ诱导小鼠外周血细胞流式细胞检测
以Cy3标记的抗CD19标记PBMC细胞，圈出CD19阳性的细胞群，分别设置未染TSPAN33抗体组（图3A），正常对照组（图3B）以及STZ诱导组（图3C），用流式细胞仪检测，STZ诱导自身免疫糖尿病组B细胞表达的TSPAN33相对正常对照组有所升高，
 
 
图3.STZ诱导小鼠外周血B细胞中TSPAN33表达的流式细胞检测
2.3 T1DM病人外周血细胞流式细胞检测
来自临床诊断为T1DM患者的外周血，未染TSPAN33抗体组（图4A），正常对照组（图4B）以及T1DM患者（图4C），流式细胞仪检测各组外周血B淋巴细胞，T1DM患者外周血中TSPAN33的表达量高于健康体检人员。通过检测TSPAN33在总体CD19+B细胞中的表达比例，发现T1DM病人组TSPAN33表达量从整体上高于健康体检组（P<0.01）。
 
图4. T1DM病人外周血B细胞中TSPAN33表达的流式细胞检测
 
讨论
TSPAN33作为一种新型B细胞的标志物，其可能参与B细胞的活化，如信号传导、细胞成熟、抗原递呈等过程[4-6]，其一方面可能与非霍奇金淋巴瘤和白血病有关，另一方面与许多自身免疫性疾病如类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）等有关[1]。有报道表明在糖尿病患者的尸检中发现糖尿病与TSPAN33的表达有联系，TSPAN33与HbAlc有较高的结合率，相比于正常血糖而言，在高血糖环境中TSPAN33更容易被其siRNA 沉默，并且血糖浓度的降低能下调其基因的表达[7]。我们的实验结果也证明，B细胞表面表达的TSPAN33分子在自身免疫性糖尿病中起着重要作用。在STZ诱导的自身免疫性糖尿病模型和临床糖尿病患者体内的外周血检测中发现，血中的TSPAN33表达均有上升。与人类相似，在小鼠模型中有报道显示TSPAN33在正常的B细胞中表达量明显低于活化的B细胞[8]，并且只有在B细胞活化时才会高表达[1,9]。故如果以TSPAN33为突破口，制备能特异性中和B细胞抗体，在治疗一些与B细胞相关的自身免疫方面有着重要的意义[10,11]。

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