【分　 类】 医药卫生
【关 键 词】 侵袭性肺部光滑念珠菌感染；Dectin-1受体； IL-10
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正文：
【摘要】目的：探讨Dectin-1对大鼠侵袭性肺部热处理光滑念珠菌感染的免疫识别及IL-10的表达和意义。方法：将36只大鼠随机分为3组：对照组（A组）、活光滑念珠菌感染组（B组）及热处理光滑念珠菌感染组（C组）。建立大鼠侵袭性肺部感染模型，在第3天及第6天各处死6只大鼠，观察肺组织病理形态学改变，用酶联免疫吸附法测定肺泡灌洗液中IL-10、TNF-α的表达，用蛋白免疫印迹法检测肺组织Dectin-1的表达，并与对照组比较。结果：A组大鼠肺组织正常；B、C组肺泡结构消失，肺泡腔及间质大量炎性细胞浸润。B、C组肺泡灌洗液中TNF-α及IL-10的表达和肺组织Dectin-1均呈进行性升高，且C组高于B组。结论：Dectin-1参与了大鼠侵袭性肺部热处理光滑念珠菌感染的免疫识别， IL-10起负性调节的作用。
关键词: 侵袭性肺部光滑念珠菌感染；Dectin-1受体； IL-10
 
 
Immune recognition in rats with the heat-treated Candida glabrata invasive pulmonary infection by Dectin-1 and the expression of IL-10
Wu Chenglin1, Luo Xueping2,Wu Ye1, Zhang Xue1
(1、Guilin Medical College；2、ICU, the Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, China)
【Abstract】Objective: To explore immune recognition of Dectin-1 receptor in the rats with the heat-treated Candida glabrata invasive pulmonary infection, and the expression and significance of IL-10. Methods: The rats were divided into three groups including the control group (group A), the group of rats infected with the live Candida glabrata (group B) and the group of rats infected with the heat-treated Candida glabrata (group C). Set up the model of the rats invasive pulmonary infection. Each group was sacrificed 6 mice respectively at the third and sixth day, observing the pathological changes of lung tissue, detecting the IL-10 and TNF-α expression in BALF by ELISA, using Western blot assay Dectin-1 expression in lung tissue, and then comparing them with the control group. Results: The pathological analysis showed the normal structure and no inflammatory reaction in lungs in group A; while in group B and group C, the normal structure of the alveolar disappeared, amount of inflammatory cells infiltration is visible in the alveolar space and interstitial. The expression of Dectin-1 in the infected lung tissues and the expression of IL-10 and TNF- α in BALF were all progressive increased in group B and C, and the group C expressed higher than group B. Conclusion: Dectin-1 involved in the immune recognition in the rats with heat-treated Candida glabrata invasive pulmonary fungi infection and IL-10 played a negative regulatory function.
Key words: Invasive infections with Candida glabrata；Dectin-1 Receptor；IL-10
 
*基金项目：广西医疗卫生重点科研课题 （编号：重2012007）；广西自然科学基金项目（编号：2013GXNSFAA019209）
作者简介：吴呈霖（1987~），住院医师，硕士研究生，主要从事重症感染方面研究
通讯作者：骆雪萍，女，教授，Email:xueping-l@sohu.com
 
近年来，随着广谱抗生素、糖皮质激素等的应用，各种介入手段的开展、免疫缺陷人群的增多等，侵袭性肺部真菌感染（invasive pulmonary fungal infection，IFI）已成为重症监护病房（intenstive care unit，ICU）医院内感染的重要部分。在选择性使用氟康唑预防及治疗压力下，非白念珠菌所占比例明显增加甚至远远超过白念珠菌[1]。其中光滑念珠菌已成为非白念珠菌中第2位或第3位的致病念珠菌[2]。本研究通过建立大鼠侵袭性肺部活光滑念珠菌及热处理光滑念珠菌感染模型，拟探讨Dectin-1对大鼠侵袭性肺部热处理光滑念珠菌感染的免疫识别，以及IL-10的表达及意义。
1.材料与方法
1.1 实验动物  清洁级健康SD大鼠，雌性，6~8周龄，体重200±20g，购于广西医科大学实验动物中心。
2.2 菌株 标准光滑念珠菌，编号：9527，购自上海酶联生物科技有限公司。将光滑念珠菌标准菌株接种于沙堡培养基在37℃真菌培养箱培养48h后，挑取菌落于灭菌磷酸缓冲液（PBS）冲洗2次，用比浊法将光滑念珠菌配制成混悬液，使其含菌量为5 x 108cfu/ml。热处理组光滑念珠菌，将上述菌液于56℃坏境下30min，进行热处理[3]。
1.3 方法  
1.31 实验动物分组：将动物随机分成对照组（A组）、活光滑念珠菌感染组（B组）、热处理光滑念珠菌感染组（C组），每组各12只。
1.32 动物模型的建立：三组大鼠均连续3天肌肉内注射地塞米松，剂量为0.6mg（kg*d），3天后分别建立A、B、C三组模型。A组模型：使用水合氯醛腹腔注射麻醉、固定后，消毒颈部皮肤，连续3天用1ml注射器经气管注入0.3ml灭菌PBS缓冲液；B组模型：按上述方法麻醉、固定、消毒后，连续3天气管注入0.3ml真菌混悬液；C组模型：按上述方法麻醉、固定、消毒后，连续3天气管注入0.3ml热处理真菌悬液。接种后立即竖立大鼠固定台，使其保持直立轻微晃动3min，使菌液及PBS缓冲液完全均匀分布于两侧肺组织。
1.33 标本采集
1.331 肺泡灌洗液的收集 于造模后的第3天、第6天每组随机选取大鼠各6只，将大鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉固定，经膈肌开胸心脏穿刺放血处死大鼠后结扎右肺门。分离颈部气管，在气管下段作一小“T”形切口，插入一次性静脉输液导管深度约2.5cm 并固定，将2.5ml提前4℃预冷的灭菌PBS灌入左肺，缓慢回抽3次为灌洗一次，共二次，回收率约80%。将肺泡灌洗液（Broncho Alveolar Lavage Fluid，BALF）4℃ 1200r/min离心10min，取上清液，严格按照ELSIA试剂盒说明检测TNF-α、IL-10。
1.332 肺组织的采集  
每组大鼠经膈肌开胸心脏放血后，分离右肺，取上叶肺组织置于4%多聚甲醛固定液中固定做HE染色。分离右肺，取中叶、下叶肺组织用于蛋白免疫印迹法，检测Dectin-1蛋白表达。
1.4 统计学分析
    所有指标均以均数±标准差表示，使用SPSS 13.0 统计软件进行分析，组内比较采用独立样本的t检验，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 肺组织病理学结果
2.1.1 大体观察：肉眼观察A组肺组织形态正常，表面光滑呈粉红色，边缘锐薄。B组和C组肺组织充血，表面可见凸凹不平、大小不一的灰白色病灶，周围组织充血，第6天较第3天严重。
2.1.2  HE染色观察：显微镜下A组可见肺泡结构清晰完整，肺泡清亮，无充血及炎性细胞浸润，第3天和第6天肺组织无明显区别。B组和C组均可见肺组织内多个坏死区域，界限不清晰，病灶之间有融合，肺泡结构消失，肺泡腔及间质可见有大量炎性细胞浸润，上述改变第6天较第3天严重。
图1.三组肺组织HE染色观察
 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

注：A:A组(HE染色,X20)；B:A组(HE染色,X40)；C:B组3d(HE染色,X20)；D:B组3d(HE染色,X40)；E:B组6d(HE染色,X20)；F:B组6d(HE染色,X40)；G:C组3d(HE染色,X20)；H:C组3d(HE染色,X40)；I:C组6d(HE染色,X20)；J:C组6d(HE染色,X40)
2.2 三组肺泡灌洗液TNF-α、IL-10的表达及比较
三组间比较：造模后第3天及第6天TNF-α、IL-10表达水平B组和C组均明显高于A组（P＜0.01）。且C组高于B组（P＜0.01）

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