摘要目的：建立一种高效液相色谱法测定滴眼用利福平中的有关物质。方法：用辛基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm,5μm)：以甲醇-乙腈-0.075mol/L磷酸二氢钾溶液-1.0mol/L枸橼酸溶液(30:30:36:4)为流动相;检测波长为254nm;流速为1.0mL/min. 结果：醌式利福平对照品、N-氧化利福平对照品、3-甲酰利福霉素SV对照品在各自的浓度范围内呈现良好的线性关系(r2= 0.9996～0.9999，n=5),最低检出限范围为0.1～0.3μg/mL;结论：该方法的检测灵敏度高、精密度好、准确度高、线性关系良好，能够满足对滴眼用利福平质量的控制要求。

　　关键词：滴眼用利福平;有关物质;残留溶剂高效液相色谱法;

　　Determination of Related Substances in Rifampicin for Eye Use by HPLC

　　HU Zekai，XIONG Wen (Institute for Food and Drug control of Chengdu,Chengdu 610045)

　　ABSTRCT: OBJECTIVEA HPLC method is established and validated for the determination of related substances in rifampicin for eye use. METHODS: The samples were analyzed by using C8 column(250mm×4.6mm,5μm), 254nm detection wavelength, and the mobile phase consisting of methanol: acetonitrile: 0.075mol/L potassium dihydrogen phosphate: 1.0 mol/L citric acid (30:30:36:4). The flow rate was 1.0ml/min. RESULTS: Linear relationships were obtained for the rifampicin quinine, rifampicin N-oxid, 3-formylrifamycin SV in their respective concentration ranges (r2= 0.9996～0.9999，n=5) ，and the detection range was from 0.1to 0.3μg/mL. CONCLUSION: The method showe the advantages of high sensitivity，good accurancy，linearity and can be used for the determination of residual solvents in related substances in rifampicin for eye use.

　　KEY WORDS: Rifampicin for eye use;Related Substances; HPLC;

　　利福平(又译：利发霉素、甲哌利福霉素、甲哌力复霉素、威福仙、仙道伦、力复平或利米定，INN：Rifampicin)是一种所属利福霉素家族的一种广谱抗生素药物，对结核杆菌有较强抗菌作用，对革兰氏阳性或阴性细菌、病毒等也有疗效。为红色或暗红色的结晶状粉末，不溶于水。一般为胶囊或者片剂口服药，与其他抗结核药合用起协同作用，并延缓耐药菌株产生。主要用于治疗结核病、脑膜炎和金黄色葡萄球菌感染。外用可治疗沙眼、结膜炎、角膜炎、角膜溃疡等病症【1】。

　　滴眼用利福平由含利福平主药的固体制剂和供溶解主药的缓冲液两部分组成，临用时配制成滴眼液。不同厂家的产品，其固体制剂的剂型和缓冲液的处方各不相同。该品种的现行质量标准为国家药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1027)-2002，收载在国家药品监督管理局(化学药品地方标准上升国家标准)第十一册中，主要项目有化学鉴别、滴眼剂和丸剂、片剂的通则检查以及含量测定。《中国药典》2010年版二部上收载有“利福平滴眼液”品种，其药物组成与利福平滴眼液基本一致，检查项目与方法有所不同。《中国药典》2015年版二部无此品种收载。 仪器与试药 1.1 仪器

　　Agilent 1260 高效液相色谱仪; SK5200H超声波清洗仪( 工作频率59 KHz，上海科导超声仪器有限公司);Sartorius BP211D分析天平( 德国赛多利斯，感量:0.01 mg)。 药品与试剂 滴眼用利福平3批( 批号代码: A,B,C), 由国内某厂家提供;甲醇、乙腈均为色谱纯(Fisher Chemical)磷酸二氢钾、枸橼酸均为分析纯( 成都市科龙化工试剂厂) 。 方法与结果 色谱条件及系统适用性试验 采用Agilent ZORBAX SB-C8(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，以甲醇-乙腈-0.075mol/L磷酸二氢钾溶液-1.0mol/L枸橼酸溶液(30:30:36:4)为流动相;检测波长为254nm。进样量为10μl，流速为1.0mL/min。利福平峰、 醌式利福平峰、N-氧化利福平峰、3-甲酰利福霉素SV峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。 溶液的制备 对照溶液的制备 精密称取利福平对照品适量，加少量乙腈(约10mg加1ml乙腈)溶解后，再用乙腈-水(1:1)定量稀释制成每1ml中约含10ug的溶液，作为对照溶液;另精密称取醌式利福平对照品、N-氧化利福平对照品、3-甲酰利福霉素SV对照品各适量，分别加乙腈适量(约10mg加1ml乙腈)溶解后，再用乙腈-水(1:1)定量稀释制成每1ml中各约含10ug的溶液，分别作为对照溶液(1)、(2)、(3);

　　2.2.2 供试品溶液的制备

　　取本品10片(丸、管)，精密称重，研细，精密称取细粉(约相当于利福平25mg),置25ml容量瓶中，加所附的缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过,作为供试品溶液。

　　2.3 专属性试验

　　取利福平对照品、醌式利福平对照品、N-氧化利福平对照品、3-甲酰利福霉素SV对照品各适量，加乙腈适量(约10mg加1mL乙腈)溶解后，再用乙腈-水(1:1)定量稀释制成每1ml中约含40ug的混合溶液，取10μl进样。各相邻色谱峰间的分离度均符合要求，结果见图1。

　　1.醌式利福平;2.利福平;3. N-氧化利福平峰;4. 3-甲酰利福霉素SV

　　图1有关物质专属性色谱图

　　取本品细粉适量，照2.2.2项下制成供试品溶液，取供试品溶液1mL，加0.5mL 0.1mol/L盐酸，室温放置半小时后用0.1mol/L氢氧化钠中和至中性，作为酸解样品;取本品细粉适量，照2.2.2项下制成供试品溶液，取供试品溶液1mL，加0.2mL 0.1mol/L氢氧化钠，室温放置10分钟后用0.1mol/L盐酸中和至中性，作为碱解样品;取本品细粉适量，照2.2.2项下制成供试品溶液，取供试品溶液1mL，加1ml 1.0%过氧化氢溶液，室温放置1小时，滤过，作为氧化降解样品。

　　取上述各破坏性样品溶液10μl进样， 结果试验证实该法能有效检测出各破坏性试验产生的降解物，且降解产物峰均能与主成分峰达到基线分离，因此，所建方法对相关降解产物检查的专属性较好。

　　2.4线性关系考察

　　精密称取利福平、醌式利福平、3-甲酰利福霉素SV 、N-氧化利福平对照品各约10mg,置 50ml量瓶中， 加1ml乙腈溶解后，用乙腈-水(1:1)稀释至刻度， 摇匀， 得1ml中含利福平、 醌式利福平、3-甲酰利福霉素SV、N-氧化利福平各200μg的对照品储备液。取上述各储备液0.25、1、2.5、5和20ml置于50ml容量瓶中，加乙腈-水(1:1)稀释至刻度， 摇匀，制备成一系列浓度标准溶液。按有关物质检测方法进样。

　　表1标准曲线的回归方程( n：5) 化合物 回归方程 r2 浓度范围(μg/ml) 利福平 y = 11.89x 0.9999 1.1-80.3 醌式利福平 y =9.031x 0.9996 1.2-80.1 3-甲酰利福霉素SV y = 15.68x 0.9999 1.1-80.2 N-氧化利福平 y = 8.866x 0.9997 1.3-80.1 检出限及定量限 取醌式利福平、3-甲酰利福霉素SV、N-氧化利福平浓度为1μg/ml的对照溶液，逐级稀释，按S/N为3，确定检出限为0.1、0.3、0.3μg/ml。按S/N为10，确定检出限为0.3、1.0、1.0μg/ml。 精密度试验 取利福平、醌式利福平、3-甲酰利福霉素SV 、N-氧化利福平浓度为10μg/ml的对照品溶液，按照有关物质检测的条件，分别进样10μl,各进6次,结果利福平、醌式利福平、3-甲酰利福霉素SV 、N-氧化利福平的RSD%分别为0.85%、0.35%、3.16%、1.39%。 加样回收试验 将浓度为200μg/ml浓度的各杂质对照品分别量取5ml，置于10ml容量瓶中，用乙腈-水(1:1)稀释至刻度， 摇匀， 得1ml中含醌式利福平、3-甲酰利福霉素SV、N-氧化利福平各100μg的对照品溶液。称取供试品(约相当于利福平10mg)3份分别置10ml量瓶中，分别加入醌式利福平对照品溶液、N-氧化利福平对照品溶液，3-甲酰利福霉素SV对照品溶液各1ml，进样测定，考察加样回收率。结果均大于95%。 样品试验 取3批样品。照上述确定的方法测定，结果见表2

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