【分　 类】 农业与自然
【关 键 词】 波尔山羊羔羊；超数排卵；体外成熟；体外受精
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正文：

1.2.3卵母细胞的体外成熟培养（IVM）
成熟液：TCM199＋2.2mg/mL NaHCO3＋10mmol/L HEPES＋0.5%FCS＋0.25mmol/ L Na-Py＋2.75mmol/L 乳酸钠＋10μg/mL FSH＋10μg/mLLH＋25ng/mLEGF＋100IU/mL青霉素＋100μg/mL链霉素
在显微镜下，用巴氏管吸出可用卵母细胞，将可用卵母细胞在成熟液中洗2次，移入100 μL成熟培养液微滴中，微滴上覆盖石蜡油（在培养箱中预先平衡4 h），每个微滴放入卵子约20枚，饱和湿度、39 ℃、5%CO₂培养箱中成熟培养24 h。
1.2.4精子获能处理及体外受精（IVF）
SOF工作液：SOF原液+1mmol/L谷胺酰胺+0.3mmol/L Na-Py丙酮酸钠
洗卵液：SOF工作液+10mmol/L HEPES+5mmol/L NaHCO3+0.3％BSA+100IU/mL青霉素+100μg/ml链霉素
洗精液：成份同洗卵液，双抗加双倍量
获能液：SOF工作液+20%发情羊血清+10mmol/L青霉胺+10mmol/L亚牛黄酸+10μg/m肝素+0.5mol/L乳酸钙+100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素
精液采用北京市昌平区百善镇盛世富民清真食品有限公司的新鲜精液。
采回的鲜精用洗精液以1500转/分离心 5 min，洗1～2次，弃去上清。将沉于离心管底部的精子加入提前平衡好的获能液中，上游30 min。将成熟的卵母细胞用0.5％的透明质酸酶处理，除去部分颗粒细胞，用受精液洗3次，最后移入受精滴中。取经上游处理的精子加入含卵子的受精滴中，每滴10μL精子，精子密度约为5×10⁶个/mL，置于38.5℃、5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养17～19 h。
1.2.5受精卵的体外培养（IVC）
胚胎培养液：SOF工作液+10%FCS+2%必需氨基酸(BME-EAA)+1%非必需氨基酸(MEM-NEAA) +100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素
受精卵的培养采用与颗粒细胞单层共培养法。卵母细胞与精子共孵育17～19 h后，受精卵在洗卵液中洗2～3次，将外周颗粒细胞和精子冲洗掉，然后在胚胎培养液中清洗两次，移入含有颗粒细胞单层的培养微滴中，38.5℃、5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养，隔天半量换液。48h统计卵裂率，6d～10d统计囊胚率。
1.2.6统计分析
全部数据用方差分析法进行统计处理。
 

2. 结果与分析

2.1 不同超排方案的超排效果
表1  不同超排方案获卵结果
Table 1  the effect of superovulation in different methods

组别   groups	卵巢平均重量（g） ovaries average weight (g)	卵泡直径（mm）follicular diameter (mm)	获得卵母细胞数oocytes	可用卵母细胞数（平均可用卵母细胞数） the valuable oocytes (average the valuable oocytes)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ	6．0 5．9 17．6 16．0	1—3 2—3 3—5 2—5	54a 96b 467c 301d	49(12.25)a 87(22)b 429(107)c 293(72)d

注：在同一列数据中肩注字母不同者为差异显著(0.01<P<0.05)。
Note: Note: The different letter in the same column means significant difference(0.01<P<0.05).
    从表1可以看出，不同超排方案获得的卵母细胞数量有差异，其中CIDR+PMSG+FSH处理组和CIDR+FSH处理组获得卵母细胞数和可用卵母细胞数显著高于GnRH+FSH处理组和PMSG+FSH处理组，各组差异显著(0.01<P<0.05)。
2.2 体外成熟和体外受精的效果
表2  不同超排方案卵母细胞体外成熟和体外受精结果
Table 2  The results of IVM and IVF of oocytes from 4 treatments superovulation

	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ
卵裂率（%） cleavage rate(%)	27a	21a	60.2cd	69b
囊胚率（%） blastula rate(%)	7a	6.5a	18bc	13bc

注：在同一行数据中肩注字母相同者差异不显著(P>0.05)；不同者为差异显著(0.01<P<0.05)；肩注两个字母为差异极显著(p<0.01)。
Note: Note: The same letter in the same column means no difference existing (P>0. 05); but different letter means significant difference (0.01<P<0.05); two different letters means extremely significant difference (P<0.01).
    表2显示，用不同超排方法后卵母细胞体外成熟和体外受精的结果差异显著。CIDR+FSH处理组卵裂率最高（69%），显著高于GnRH+FSH处理组（27%）和PMSG+FSH（21%）处理组，差异极显著（0.01<P）。CIDR+PMSG+FSH处理组囊胚率最高（18%），显著高于GnRH+FSH处理组（7%）和PMSG+FSH（6.5%）处理组，差异极显著（0.01<P）。
 
3.讨论与结论
羔羊超数排卵技术是根据幼龄羔羊卵泡发育的独特生理特点而提出的一项获取绵羊卵母细胞的新技术。羔羊出生前后卵巢上就有卵泡发育，Kallta等研究发现山羊出生后至6月龄，卵巢上有腔卵泡的体积一直在增加。刚出生的山羊卵巢上没有格拉夫氏卵泡，并且总卵泡数一直增加至2月龄，之后卵泡数开始下降至5月龄^[7,8] ，到性成熟时期卵泡发育数量降到一个较低的稳定状态。在奶山羊上在第一次排卵来临时出现第二次有腔卵泡数量和体积生长高峰。幼龄羔羊卵巢上卵泡的发育并不出现卵泡波峰，卵泡发育很少发生闭锁，并且不受季节影响^[9]。因此，对幼龄羔羊进行促性腺激素处理可获得较成年羊更为理想的超排效果，其中以羔羊卵巢上卵泡发育数量达到最高峰阶段进行超数排卵处理的效果为最佳^[10]，并且幼畜最初的有腔卵泡数量和体积的增加与FSH明显地脉冲分泌向FSH峰明显地缺少转变一致^[11,12]。排卵前卵泡数量体积的增加很可能受LH分泌峰增多所促使^[12,13]。通过实验手段诱导山羊初情期，也就是通过高频率GnRH的释放和雌二醇浓度的增加，证实了FSH活性变化以及FSH异构体分布的变化，由此推论出幼畜激素生物学活性的短暂增加启动了有腔卵泡数量的增加

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