正文:摘 要:目的:为探索波尔山羊羔羊超数排卵的可行性及体外受精情况。方法:本实验应用四种不同的促性腺组合,对16只7周龄大的波尔山羊羔羊超排,并进行采卵及体外受精。结果:共获得卵母细胞918枚,其中超排处理Ⅰ组到Ⅳ组的可用卵母细胞数分别为49,87,429,293枚,各组间差异显著(0.01<
P<0.05)。卵母细胞进行体外培养24 h后与上游法获能的精子体外受精,48 h后各组的卵裂率分别为27%,21%,60.2%,69%,其中CIDR+PMSG+FSH处理组与GnRH+FSH处理组和PMSG+FSH处理组差异极显著(
P<0.01);6 d到10 d各组囊胚率分别为7%,6.5%,18%,13%,PMSG+FSH处理组和GnRH+FSH处理组与CIDR+PMSG+FSH处理组差异极显著(
P<0.01)。:结论:结果提示,CIDR+FSH处理组和CIDR+PMSG+FSH处理组能明显提高超排效果和卵裂率、囊胚率。
关键词:波尔山羊羔羊;超数排卵;体外成熟;体外受精
The Investigation of In Vitro Fertilization of Boer Goat Lamb’s 0oeytes Obtained from Different Superovulation
Abstract: Objective: In order to investigate the fertilization
In Vitro of Boer goat lamb’s ooeytes obtained from superovulation. Method: 16 kids aged 7-weeks-old of Boer goat were superovulated by 4 treatments with FSH, PMSG and/or CRID, and then the follicular ooeytes are recovered from their ovaries surgically. Result: The results show that: 918 follicular oocytes were obtained, and the valuable oocytes are 49, 87, 429 and 293 after the superovulation treatments with different injections respectively (0.01<
P<0.05). The ooeytes were fertilized
in vitro with the sperm capacitated by swim up after being cultured for 24 hours
in vitro. The cleavage rates after 48 h were 27%, 21%, 60.2%, 69% respectively. Treatment with CIDR+PMSG+FSH had an
基金项目:北京市教委资助项目
作者简介:常迪(1985-),女,硕士研究生,主要从事产科与胚胎工程的研究。Email: sissi_gy@yahoo.com.cn;Tel:010-80799468
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通讯作者:倪和民,副教授,E-mail::nihemin@yahoo.com.cn
advantage over method of GnRH+FSH and PMSG+FSH(
P<0.01). The blastocyst rates between
6 d and 10 d were 7%, 6.5%, 18%, 13%. Treatment with CIDR+PMSG+FSH had an advantage over method of GnRH+FSH and PMSG+FSH(
P<0.01).Comclusion: These results indicated that cleavage rate and blastula rate could be obviously increase by treatment with CIDR+PMSG+FSH and CIDR+FSH.
Key words: Boer goat lamb; superovulation; IVM; IVF
波尔山羊是世界上公认的肉用山羊品种,以生长快、肉质好、繁殖率高、适应性强、性情温顺、好饲养、抗病力强而闻名于世。近些年,波尔山羊在我国得到了大力推广,并对当地羊的改良起到了较好的作用。超数排卵技术可以从母畜卵巢上获得大量卵母细胞,提高繁殖效率,扩大波尔山羊种群。
体外受精技术自1878年发现以来,先后在兔、小鼠、大鼠、人、猪、牛、羊上用体外受精技术生产“试管”动物,并得到成功。和其他家畜相比羊的体外受精技术发展相对较晚,1985年花田章首次报道了用体外受精的方法生产出“试管”羊
[1]。经过20多年的科学研究,羊的体外受精技术有了很大的进步,对幼畜激素诱导后生产胚胎也做了不少研究,并取得了一定的成果。上世纪70年代初,Worthington对5—6周龄的羔羊注射hCG,发现羔羊卵巢上大量卵泡开始发育
[2]。Trounson对10—16周龄青年羔羊的卵母细胞进行体外研究,结果发现其卵母细胞在体外也可以发育到囊胚
[3]。90年代以后,人们对羔羊卵泡的发育进行了更为深入的研究。利用激素诱导获得卵母细胞生产出的早期胚胎,其卵裂率和囊胚率分别能达到63%和20%左右
[4]。
在我国,羊的超数排卵中多采用成年母羊,很少使用羔羊作为胚胎供体。幼畜卵泡发育的研究开始于上个世纪50年代初,通过注射外源促性腺激素,先后在小牛和羔羊上获得超排卵,这一研究进展不仅可以提高动物的繁殖潜能,使卵巢上的卵母细胞得到充分利用,而且还可以大大缩短世代间隔, 加快良种培育进程
[5,6]。
幼畜胚胎体外生产技术,是集幼畜的超数排卵与采卵、卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植等技术为一体的生物高技术体系。此技术不仅可以提高动物的繁殖潜能,使正常情况下闲置不用的卵巢卵母细胞资源得到充分利用,而且还可以缩短世代间隔,加速遗传改良进程。此项技术可以使繁育成本下降60%,不仅可以应用到种羊生产,也可以应用到母羊生产,加快基本生产群体繁育速度。其效率是成年绵羊常规胚胎移植的20倍,是自然繁殖的60倍左右。但国内使用羔羊超排并进行体外受精、胚胎生产的报道还不多。
本试验采用不同的超排方法处理波尔山羊羔羊,观察其超排效果,并对获得的卵母细胞进行体外成熟和体外受精的试验,探讨以波尔山羊羔羊作供体进行超数排卵生产卵母细胞的可行性,以及对卵母细胞进行体外成熟和体外受精的效果研究。
- 材料和方法
1.1材料
1.1.1试验时间、地点
2008年4月北京市顺义区沃德尔羊场
1.1.2试验动物
选取7周龄波尔山羊羔羊16只,体重9—11 kg,分成四个实验组,每组各4只。
1.1.3主要试剂
释放型阴道栓(CIDR新西兰哈密尔顿生物公司);孕马血清促性腺激素(PMSG 宁波市激素制品有限公司,批号 20070909);垂体促卵泡素(FSH 中国科学院动物研究所,批号 20020201);促性腺激素释放激素(GnRH 宁波三生药业有限公司);葡萄糖、NaCl等无机试剂均为国产优级纯产品,其余药品和试剂均购于Sigma公司。
1.2方法
1.2.1超排方案
Ⅰ.GnRH+FSH:肌肉注射200 IU GnRH,记为第0天,从第1天开始每日注射两次FSH,每次3 mg,连续注射3天,第4天采卵。
Ⅱ.PMSG+FSH:肌肉注射200 IU PMSG,记为第0天,从第1天开始每日注射两次FSH,每次3 mg,连续注射3天,第4天采卵。
Ⅲ.CIDR+PMSG+FSH:按照CIDR(含5 mg孕酮)要求将其放入试验母羊阴道,记为第0天,第3天肌肉注射PMSG 400 IU,第7—9天连续3天每天早晚各注射一次FSH,每次3 mg,第10天撤栓采卵。
Ⅳ.CIDR+FSH:按照CIDR(含5 mg孕酮)要求将其放入试验母羊阴道,记为第0天,第7—9天连续3天每天早晚各注射一次FSH,每次3 mg,第10天撤栓采卵。
1.2.2卵母细胞的采集
采卵液:TCM199+25mmol/LHEPES+2.2mg/mLNaHCO3+2%FCS+100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素
用外科手术的方法取出羔羊的卵巢,在天平上称重后,置于37 ℃生理盐水中,在无菌操作台上用剪刀对卵巢进行修剪,剪去多余的脂肪及黄体。在一次性培养皿中倒入少量采卵液,用刀片划破卵泡,在采卵液中释放出卵母细胞。
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