摘要 通过间接免疫组化方法，采用激光共聚焦显微镜观察兔味蕾细胞的gustducin免疫反应。结果表明分离后的味蕾细胞在没有神经支配的情况下仍然能够表达gustducin。同时也证明采用分离味细胞来进行味觉兴奋性的研究模型是可行的，分离出的细胞保留完好的味受体及离子通道。

　　关键词 味细胞;味蕾;Gustducin;激光共聚焦显微镜

　　近几年来味感觉研究的一个重大突破是G蛋白Gustducin的发现，带动了味觉分子生物学的进步[1]。在哺乳动物中，G蛋白有α、β和γ三个多肽亚基，因α亚基与GTP结合和水解相关而备受关注。Gustducin是G蛋白α亚基中的二级受体，被认为是味细胞的特异受体，与味觉传递机制相关。国外围绕Gustducin展开了较多研究[2-4]，但研究的对象大体上是基于培养中的味蕾或味乳头的组织切片进行，分离后的味蕾细胞Gustducin表达还报道较少。因而确定分离后味蕾细胞的Gustducin表达是味觉细胞分子生物学中的一个不可忽视的问题。本文通过间接免疫组化方法，采用激光共聚焦扫描显微镜观察兔味蕾细胞的gustducin免疫反应。现报道如下。

　　1.材料与方法 1.1.材料1.1.1 实验动物 实验兔，购自浙江省医学科学院实验动物中心。每只体重2kg左右，兔龄1个月。

　　1 .1.2 主要试剂 Anti-α-gustducin(Santa Cruz Biotechnology,sc-395)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Invitrogen Corporation)、多聚L-赖氨酸(华美生物工程公司)、Tyrode’s液(140mM氯化钠,5mM氯化钾,10mM HEPES,1mM氯化钙,10mM葡萄糖，1mM 氯化镁,10mM丙酮酸钠，用氢氧化钠调节pH 7.4，皆为分析纯)、无钙镁离子的Tyrode’s液(140mM氯化钠,5mM氯化钾,10mM HEPES,10mM葡萄糖，10mM丙酮酸钠，用氢氧化钠调节pH 7.4，皆为分析纯、胰蛋白酶 (中国医药集团上海化学试剂公司)、胶原酶A(Roche Diagnostics Corporation, USA)、分散酶II(Roche Diagnostics Corporation, USA)、伊文思蓝(中国医药集团上海化学试剂公司)、羊抗兔IgG-FICT (华美生物工程公司)、冰冻离心机(Sigma2K15)、CCD Camera(上海创美科技有限公司)、200目筛网(浙江上虞市华康化验仪器厂)、TCS SP2激光共聚焦显微镜(Lecia)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 味蕾细胞悬液的制备

　　分离方法参照司徒镇强[5]略作修改。兔子用戊巴比妥钠每公斤60mg腹腔注射，麻醉后迅速取出舌头置入Tyrode’s液中，清洗掉舌头表面的血迹及唾液。每个舌头注射1ml左右酶溶液(2mg/ml分散酶Ⅱ和1.0mg/ml胶原酶A)于舌上皮与其下肌肉层之间。室温下舌头于无钙镁离子的Tyrodes’s溶液中静置。待适当时间后，撕取舌上皮。撕取后的舌上皮以浆膜面朝上置于无钙镁离子的盛有Tyrodes’s溶液的培养皿中。在50×解剖镜下调整光源直至味乳头中的味蕾清晰可见。用自制的内径为75um的玻璃毛细吸管吸取味蕾置入盛有Tyrodes’s的小皿中低温冰箱中存放。取分离的味蕾剪碎后置入细胞消化液(含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA)中，在37℃下微震荡消化1h，Tyrode’s溶液洗脱，用1ml移液器吹打5min，1000r/min离心1min，弃上清液，沉积的细胞再用Tyrodes’溶液清洗，以同样的条件离心2次，最后以DMEM培养基制成细胞悬液备用。

　　1.2.2 间接免疫荧光染色

　　取上述细胞悬液20ul于多聚赖氨酸包被的盖玻片上直接制备细胞涂片，把细胞片浸入冷丙酮中固定15min。取出放入盖片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。滴加α-gustducin单克隆抗体(1：1000稀释)，置湿盒中37℃保温60min。以PBS振洗3次，每次5min，吹干。加入anti-rabbit IgG-FITC(1：120，用0.01%伊文思蓝溶液稀释)，置湿盒中37℃保温60min。以PBS振洗3次，每次5min。用50%缓冲甘油封片。用激光共聚焦显微镜观察，并用CCD捕捉荧光图像拍照。激光共聚焦显微镜参数见表1。

　　Table.1　Parameters of Laser Confocal Microscope 参数 味蕾细胞的激光共聚焦显微镜观察 三维重建 Pinhole(um)

　　X points

　　Y points

　　Z points

　　Z stemps(um)

　　Objective

　　Step Size(um)

　　Speed(mm/s)

　　Laser type

　　Laser pwr(mw)

　　Channel 1

　　PMT1 51.5

　　512

　　512

　　40×

　　0.2

　　20

　　GreNe

　　800

　　On

　　30% 76.8

　　512

　　512

　　30

　　0.5

　　63×

　　0.2

　　20

　　GreNe

　　800

　　On

　　65% 2.结果以anti-Gustducin为免疫探针，对兔味蕾细胞涂片进行间接免疫荧光染色。应用激光共聚焦显微镜观察(图1 C和D)及CCD捕捉荧光图片(图1 A和B)，并进行三维重建(图2)。可见兔味细胞呈黄绿色荧光。说明分离后的细胞仍具有Gustducin免疫反应活性。通过共聚焦透射图与荧光图对比，可知哪些细胞是味感觉细胞与非味感觉细胞(图3)。

A B C D Fig.1 Results of a-gustducin immunofluorescence of isolated taste bud cells

　　A and B Fluorescence images(100×);C and D Confocal images(400×)

B A Fig.2 Comparison images of a-gustducin immunofluorescence of isolated taste bud cells

　　A . Confocal transmission images(400×);B. Confocal fluorescence images ;labeled cells are taste sensory cells(400×)

C B A Fig.2 Three-dimensional reconstruction of isolated taste bud cells

　　A . Confocal fluorescence images ;B. Confocal transmission images;C. Superimposed image of fluorescence and transmission (400×)

　　Fig.2 Intensity distribution of Fluorescent labeling of isolated taste bud cells

　　3.讨论近几年来味感觉研究的一个重大突破是G蛋白Gustducin的发现，带动了味觉分子生物学的进步[8]。国外围绕Gustducin展开了较多研究[2-4], Gustducin在味细胞分化过程中可以看到其表达，活体动物味蕾在去神经支配后7-14天的Gustducin表达消失[6]。分离的味细胞完全脱离了神经支配，是否还存在Gustducin的表达，这是我们的一个兴趣点。我们在实验中用anti-α-gustducin作为探针，对分离后的味蕾细胞进行免疫染色。在激光共聚焦镜显微镜和荧光显微镜下观察，味细胞呈现黄绿光，出现了gustducin免疫反应。证明分离后的细胞仍具有Gustducin免疫反应活性，能够表达。同时也证明采用分离味细胞来进行味觉兴奋性的研究模型是可行的，分离出的细胞保留完好的味受体及离子通道。

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