【分　 类】 化工与理学
【关 键 词】 苯酚；生物降解；固定化细胞
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正文：
摘要：从活性污泥和酚污染土壤中分离出的菌株XA05和FG03都具有很高的苯酚生物降解能力。16S rRNA基因序列分析表明，菌株XA05和FG03分别与Acinetobacter sp. 和Sphingomonas sp. 相关。将XA05和FG03细菌细胞以1:1的比例混合后用反复冻融的聚乙烯醇（PVA）凝胶固定，并用同等数量的自由悬浮细胞做对照，研究固定化Acinetobacter sp. XA05 和 Sphingomonas sp. FG03活细胞对苯酚的生物降解能力，同时对苯酚生物降解的影响因素进行了分析。结果表明，无论是自由悬浮细胞还是固定化细细胞对苯酚都有很高的降解能力，当苯酚初始浓度为800mg/l时，35h内苯酚的去除率都可达95%；当苯酚浓度较高时，固定化活细胞的生物降解性能优于自由悬浮培养细胞。固定化Acinetobacter sp. XA05 和 Sphingomonas sp. FG03活细胞在含酚废水生物处理中具有很好的应用潜能。
 
关键词：苯酚；生物降解；固定化细胞；Acinetobacter sp. XA05；Sphingomonas sp. FG03
 
中图分类号：Q789; X172  　文献标识码：A  　
 
Biodegradation of phenol by using immobilized cells of Acinetobacter sp. XA05 and Sphingomonas sp. FG03
 
Abstract: Strain XA05 and FG03 with high biodegradation activity of phenol were isolated from the activated sludge and phenol-contaminated soils in Northwest of China, respectively. DNA sequencing and homologous analysis of 16s rRNA gene identified that XA05 belonged to an Acinetobacter sp. and  FG03 was closely related to the Sphingomonas sp. Strain XA05 and FG03 were mixed at the ratio of 1:1, and polyvinyl alcohol (PVA) was used as a gel matrix to immobilize mixed cells of two strains by repeated freezing and thawing. Biodegradation was evaluated by determining phenol. The removal effciency of phenol and factors affecting phenol degradation were investigated, the stability of the immobilized cells was also reported. Experimental values indicated that both free culture and immobilized cells showed high phenol
 
degradation effciencies, higher than 95% within 35h with an initial concentration of 800mg/l phenol, and the immobilized cells showed better performance than that of the suspended-culture cells. These results indicate that immobilized Acinetobncter sp. XA05 and Sphingomonas sp. FG03 possesses a good application potential in the treatment of phenol-containing wastewater.
 
Key words: Phenol biodegradation; Immobilized cells; Acinetobncter sp. XA05; Sphingomonas sp. FG03.
 
    苯酚是一种非常普遍的有毒环境污染物，它主要产生于石油化工、焦化、工业树脂制造、医药以及塑料油漆业等工业生产领域^[1,2]。苯酚会对水生生物，植物和许多其它有机生物体产生危害，同时它也是生物转化过程中酶的抵制剂^[3]。因此，有效的去除苯酚对保护环境以及人类健康非常重要。
    相比于传统的物化法去除苯酚，生物降解是更加行之有效的方法^[4,5]。生物降解法之所以得到普遍认可，是因为其较低的成本和具有将苯酚彻底矿化的潜力^[6-9]。从这个意义上来说，在污染防治领域生物降解苯酚已经得到了越来越多的关注^[10-13]，同时大量具有苯酚降解能力的微生物也被分离出来并在生理和遗传学水平上对这些微生物进行了描述^[14-16]。
在废水生物处理中，活性污泥法会产生大量的固体废弃物，而固定化微生物既能有效的处理苯酚废水又不会产生太多污泥，所以受到了越来越多的关注^[17-19]。本研究的目的是将分别来自活性污泥和酚污染土壤中的Acinetobacter sp. 和Sphingomonas sp.细菌细胞固定化，研究固定化活细胞苯酚的生物降解特性，同时对苯酚生物降解过程中的影响因素以及固定化活细胞的稳定性进行了研究。
 
1、材料与方法
1.1  试剂和细菌培养条件
苯酚：纯度大于99%；PVA：平均聚合度2400-2500，购于上海化学试剂厂。其它试剂均为化学分析纯。
分离细菌所用的活性污泥样本取自西安北石桥污水处理厂，苯酚污染土壤样本取自陕北俯谷焦化厂近郊。用于苯酚降解菌株富集和分离的培养基组成为(每升含量)：0.9 g KH₂PO₄, 6.5 g Na₂HPO₄·12H₂O, 0.2 g MgSO₄·7H₂O, 0.4 g (NH₄)₂SO₄，加入1ml酵母浸膏，将培养基pH控制在7.2-7.4之间。在灭菌后的培养基中分别加入不同浓度的苯酚，30°C好氧条件下培养^[20]。
1.2 通过16s rDNA序列鉴别XA05和 FG03菌株
用引物27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和引物1492R (5’-CGGYTACC TTGTTACGACTT-3’) 对两个菌株的16s rDNA基因进行PCR扩增。PCR反应条件按Cai等人所描述的方法进行^[21]。按照说明，将PCR产物克隆到pMD 18-T载体，送交上海生物工程公司对16s rDNA基因序列进行测序。将2条分别为1400bp的核苷酸序列登陆到GenBank，序列接受号分别为XA05菌株：EU784671，FG03菌株：EU784670。将序列与NCBI GenBank数据库进行BLAST序列同源性分析，以此来对所得菌株进行初步鉴别。
1.3 细菌细胞的固定化
    将PVA固体粉末加热并溶于KH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（25 mmol/l, pH 7.2），并在室温下放置一夜。将细菌培养液以12000 r/min的转速离心5 min收集细菌细胞，然后用KH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液冲洗两次。将XA05和 FG03菌株按1:1比例混合后加入到14%PVA中，混合均匀（最终细菌浓度为25.1 mg /l，以湿重计）。在-20°C的冷冻器中冰冻至少24h，然后在4°C条件下解冻。将冻融过程再重复进行两次以提高固定化细胞的机械强度^[22]。最后将PVA凝胶切成2×2×2 (mm)的立方体，然后用KH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液彻底清洗并在4°C条件下保存。
1.4 自由悬浮细胞和固定化细胞苯酚生物降解试验
    将XA05和FG03菌种在液体培养基（每升培养基：蔗糖5g，酵母膏3g，NaCl 5g）中培养过夜，在细胞生长的对数期后期，将细菌收集并以1:1的比例混合，然后用50mM磷酸缓冲液（pH=6.8）将细胞漂洗两次。
    将同等细胞数量的自由悬浮细胞和固定化细胞分别接种到矿物培养基中，培养基以苯酚作为单一碳源并分别在不同的培养条件下培养。之后的2天每隔5h取3ml的样本，分别检测自由悬浮细胞和固定化细胞培养液中的生物量和苯酚含量。   
1.5 分析方法
使用配制了Nucleosil 120 C-18色谱柱（内径：250×46 mm; 颗径：5 µm）的液相色谱仪和Waters LC分光光度计检测苯酚，色谱分析中的流动相：乙腈氰化甲烷：水=65：35 (v/v)，流速为0.6 ml/min。使用日立U-2000分光光度计根据Bradford法检测细胞浓度，波长为595 nm。使用Aqua Lytic pH 21 检测pH值。

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