随着合成生物学与基因编辑技术的发展，在科学研究中需要编辑越来越多的基因，例如，为了构建特定功能的菌株需要进行多轮的基因编辑，而且需要通过不同基因编辑的组合构建大量菌株进行“试错”筛选。现有基因编辑方法需要引入特定筛选标记或特定抗性的质粒来完成基因编辑，这些筛选标记或质粒需要在下一轮基因编辑前去除，从而实现无痕编辑或筛选标记的重复利用。然而，筛选标记或质粒的去除效率较难达到100%（即会发生逃逸），因此在去除标记后需要进行单克隆的筛选和确认。这增加了多轮基因编辑的周期，且需要更多的培养次数，增加了基因组自发突变的风险。

　　中国科学院青岛生物能源与过程研究所研究员咸漠带领的材料生物合成技术中心，基于“剪刀石头布”策略，实现免筛选标记/质粒消除步骤的多轮基因编辑方法，相关研究成果近日发表在Nucleic Acids Research上。研究构建了三个能够循环消除的基因编辑辅助质粒（pRock，pPaper，pScissors），在按照“剪刀-石头-布”顺序分别使用这三个质粒实施基因编辑时，可同时去除上一轮基因编辑中使用的辅助质粒，从而免除了传统方法中的筛选标记或质粒消除步骤，提高了多轮编辑的速度（图1）。质粒消除效率可达到99.99-100%，几乎不会有逃逸情况。另外，该系统还存在双重检查机制：如上一轮发生了逃逸的情况，由于质粒间的拮抗作用则不能进行下一轮编辑。该研究在大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中对该方法进行了测试，快速完成了多轮的敲除、插入、替换等基因编辑操作。

　　利用本方法进行连续多轮基因编辑时，每一轮编辑仅需要进行两次培养，即一次平板培养和一次单克隆液体培养（图2），这几乎是精细基因编辑所需要的最少培养次数。这不仅缩短了基因编辑周期，还减少了基因组随机突变的可能性，这些优势在进行大规模多轮基因编辑时尤为明显。该方法是目前最快最鲁棒的多轮基因编辑策略，可与现有其他CRISPR/Cas9编辑优化策略进行联合使用，并且在未来更易于实现自动化，同样策略也可用于其他物种的基因编辑。

　　青岛能源所博士后王纪超、硕士研究生隋新悦为论文的共同第一作者，研究员赵广、咸漠为论文共同通讯作者。研究工作得到国家自然科学基金委员会、国家国防科技工业局等的资助。

　　图1.基于“剪刀石头布”策略的多基因编辑方法示意图。A.三个能够循环消除的基因编辑辅助质粒，在实施基因编辑的同时能消除上一轮的质粒。 B.相较于传统方法，本方法不需要单独的筛选标记或质粒消除步骤

图2.基于“剪刀石头布”策略的多轮基因编辑流程图。A.“剪刀石头布”基因编辑辅助质粒构建流程图。B.连续多轮基因编辑步骤流程图