摘 要：通过检索NCBI核苷酸数据库获得orf138 和orf224 开放阅读框序列，依据其保守序列设计2 对引物，对几种来源不同的小白菜和菜苔细胞质不育系及其保持系进行PCR 扩增。orf138 引物在小白菜和菜苔细胞质雄性不育系中均扩增出573bp 的片段，orf224引物只在一个菜苔雄性不育系中扩增出653bp 的片段。同源性比对发现orf138引物在雄性不育系中扩增的片断与orf138 基因同源度达100%，表明这几个雄性不育系类型分别为萝卜细胞质不育类型;orf224引物在雄性不育系中扩增的片断与orf224基因同源度达100%，表明这一雄性不育系类型为甘蓝型油菜不育类型。

　　关键词：小白菜;菜苔;细胞质雄性不育

　　在十字花科作物的优势育种中，除利用自交不亲和系以外，利用雄性不育系是一条重要的途径。利用雄性不育可以省去人工去雄，在农作物杂种优势利用上有重要应用价值。细胞质雄性不育(CMS)是由线粒体基因组的重排引起的，CMS 相关基因产生一种新的蛋白质，直接或间接破坏线粒体正常的生理功能，从而导致花粉败育(Hanson，1991)1。在芸薹属作物中已鉴定和分离出一些与CMS 有关的线粒体基因，如Ogu 型萝卜的orf 138(Bonhomme et al，1992)、Pol型甘蓝型油菜的orf 224(Brownet al，1998)、Nap型甘蓝型油菜的orf 222(Brownet al，1998)以及叶用芥菜的orf220(杨景华 等，2005)等，而研究最多、利用最广泛的是Ogu CMS和Pol CMS(侯喜林 等，1999)。

　　本研究利用油菜线粒体CMS基因特异性引物及基于重复序列的PCR引物对几种来源不同的小白菜和菜苔细胞质雄性不育材料和保持系材料进行分析和鉴定，以建立有效的小白菜和菜苔细胞质雄性不育的分子鉴定方法，为杂交品种的选育提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　小白菜不育系材料8份，保持系材料3份;菜苔不育系材料2份，保持系材料1份(表1)。

　　表1 供试的小白菜、菜苔细胞质不育系和保持系材料 小 白 菜 菜 苔 不育系及编号 保持系 不育系 保持系 紫红A;WSX-4;WSX-2; WSX-5;苏A-07;奶A;WSX-1;WXS-3 奶B

　　苏B

　　GHB-1 HA1

　　HA2 HB 1.2 方法

　　1.2.1 基因组提取和引物

　　基因组DNA的提取参照CTAB法(Murrayet al，1980)。根据油菜线粒体中的orf138 和orf224 开放阅读框保守区序列设计两对引物，引物交由金瑞斯生物科技公司合成，引物序列见表2。

　　表2 基于orf 138和orf 2个基因设计的引物 基因 /gene 引物/ prime 退伙温度/℃Tm orf 138 5′- CACTCTCCCTGTCGTTATCG3′-

　　5′- TTGTCAAAGCAATTGGGTTC 3′- 55 orf 224 5′-ATGCCTCAACTGGATAAATTCAC3′-

　　5′- TCAGCGAAAGAGATCAAGGATC 3′- 60 1.2.2 PCR 扩增

　　PCR扩增反应在PX2 ThermalCycler(Thermo Hybaid)PCR仪上进行，反应体系为15μl，其中DNA模板6ng，10×buffer 2.5μl(含MgCl2)，1.5mM dNTP， 0.4UTag DNA聚合酶(MBI)，引物(25 pmol/μl)0.6μl，加水至25μl。PCR扩增反应程序为：94℃ 30 s，50℃45 s and 72 ℃2 min，共35个循环，最后一个循环结束后再在72 ℃继续延伸10 min于4 ℃保存。 PCR产物在1.5%琼脂糖(Spain产)凝胶上电泳分离(5 V/ cm)，电泳结束后在紫外灯下观察照相。

　　1.2.3 PCR特异条带的连接转化克隆和测序

　　连接体系为5ul，0.5ulpGEM-T载体，0.5ul Ligase，2.5ul 2×Ligase，1.5ul PCR产物，然后16℃连接连接过夜，再转化TOP10 感受态细胞，进行菌液PCR，利用菌液PCR测序分析。

　　1.2.4 序列分析

　　将特异DNA 片段的核苷酸序列在NCBI 网上应用BLAST 命令( ht tp : ∥www. ncbi. nlm. nih. Gov/ blast)进行氨基酸序列同源性比对。

　　2结果与分析

　　2.1 orf1 38和orf 224引物的扩增结果

　　用设计的orf138引物和orf224引物对12份小白菜和3份菜苔材料的DNA进行扩增。用orf138设计的引物在不同材料间进行PCR 扩增，扩增结果表明不同材料间存在差异，在小白菜材料紫红A、WSX-1、WSX-2、WSX-3、WSX-4、WSX-5、苏A07A、奶A和菜苔HA1不育系中扩增出600 bp左右的条带，大小相同(图1.a);而保持系材料间均没有扩增出条带。用orf 224特异引物进行不同材料的PCR扩增，只在红菜苔材料HA1中扩增出650 bp左右的条带，其它不育材料及保持系材料间均没有扩增出差异条带(图1.b)。

　　1.紫红A;2.WSX-4;3.WSX-2;4.WSX-5;5.奶B;6.苏B;7.苏A-07;

　　8.奶A;9.GHB-1;10.WSX-1;11.WXS-3;12.HA1;13.HA2;14.HB

　　图1 a.orf138 引物PCR扩增产物电泳图谱;b.orf224 引物PCR扩增产物电泳图谱

　　2.2 测序和同源性比较

　　分别选取在orf138引物和orf224引物扩增出条带的供试材料阳性克隆进行测序。利用NCBI在线Blast功能对测序结果进行分析，结果表明利用orf138的保守序列设计的引物扩增出的片段的核苷酸序列一致性达到100%，长度均为573 bp，该片段与Ogu型胞质不育萝卜线粒体开放读码框orf138同源性为100%(图2)，说明几个来源不同的小白菜和菜苔胞质雄性不育材料同属于萝卜细胞质不育类型;同样利用orf224 的保守序列设计的引物扩增出的片段的核苷酸的长度为653 bp，该片段与Pol型胞质不育甘蓝型油菜线粒体开放读码框orf224同源性为100%(图3)，说明这个菜苔材料HA1的不育属于甘蓝型油菜细胞质不育类型。

　　orf 138AATGCAATGATTACCTTTTTCGAAAAATTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCACTCCTACT 60

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　　小白菜CMSAATGCAATGATTACCTTTTTCGAAAAATTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCACTCCTACT 220

　　orf 138GAATGTAAAGTTAGTGTAATAAGTTTCTTTCTTTTAGCTTTTTTACTAATGGCCCATATT 120

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　　小白菜CMSGAATGTAAAGTTAGTGTAATAAGTTTCTTTCTTTTAGCTTTTTTACTAATGGCCCATATT 280

　　orf 138TGGCTAAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTGTTTACGAACCATGAGACATCTAGAGAAG 180

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　　小白菜CMSTGGCTAAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTGTTTACGAACCATGAGACATCTAGAGAAG 340

　　orf 138TTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATAAAATCA 240

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　　小白菜CMSTTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATAAAATCA 400

　　orf 138AATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTaaaggggaaatagag300

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　　小白菜CMSAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAAATAGAG 460

　　orf 138gggaaagaggaaaaaaaagaggggaaaggggaaatagaggggaaagaggaaaaaaaagag360

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　　小白菜CMSGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAG 520

　　orf 138gggaaaggggaaatagaggggaaagaggaaaaaaaagaggtggaaaaTGGACC 413

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　　小白菜CMSGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGTGGAAAATGGACC 573

　　图2 小白菜CMS与Ogu CMS萝卜orf 138 核苷酸序列同源性比较

　　orf 224TCGTTCACCTTGGCTCTCTGCGAATCTCGCAGACGATCAAGGTGCCGAAAGATCCGAAAG 60

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