石英毛细管分别以高纯水、O.1 moL/LNaOH冲洗3min后，用缓冲液冲洗至基线平稳，然后以气动进样的方式进样10s，加电压10kv运行，阴极紫外(214nm)检测。

　　2.3 高效液相色谱法(HPLC)

　　HPLC是19世纪60年代末发展起来的新型分离分析技术，根据样品在固定相和流动相分离过程的物理化学原理可分为分配色谱(正相、反相)、离子交换色谱、凝胶色谱和反相色谱等。它的出现为肽类物质的分离提供了有利手段。近年来，HPLC被成功用来分离、鉴定和纯化合成肽等。HPLC分离效果好，速度快，样品容量大，回收率高，已成为生物多肽的主要分离纯化方法[11]。在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。

　　2.3.1反相高效液相色谱(RP—HCPC)

　　RP-HLPC是现代生物技术的基本分离手段。分离纯化分析肽时最常用的方法是RP-HLPC。肽分子的某些疏水部分、亲水部分与色谱固定相表面产生疏水作用、氢键等多点吸附作用，通过改变流动相的离子组成、有机溶剂和pH从而影响保留时间。与其他方法相比其主要特点是肽的回收率高，一般大于80%,同时分辨率高于离子交换色谱和疏水色谱，使用范围广【12】。缺点在分离过程中需要使用可能导致蛋白质类分子失活的条件，以及其它因为使用有机溶剂引起的问题。分子量小于25，000u的肽类化合物在分离时一般可以保持其构想，因此RP—HCPC是分离小肽的首选方法【13】。主要用于分子量低于5000，尤其是10000以下的引性小分子肽的分离纯化[5]。在RP—HLPC分析中，采用多线性回归方法得到氨基酸组成和肽残基数量与保留性质关系，可用氨基酸及其端基的保留常数的加和值预测肽的保留时间，所以可以据此得到多种肽的最佳分离提取条件【14】【15】。

　　2.3.1.1C18 反向柱分离

　　由于键合填料在HPLC上的应用，出现了采用C18等反向柱、以紫外分光检测器或电化学检测器分离检测肽的新方法。样品经过高速离心及超滤等适当处理后，直接注入反向化学键合柱(C18填料)的液相色谱体系，以已腈和TFA为流动相，肽在两相中进行分配分离，于紫外检测器220nm波长下进行液相色谱定量分析。

　　步骤：(1)样品处理：将样品溶于流动相中，’离心，上清液经0.2μm滤膜于过滤后进样。

　　(2)绘制各肽的标准曲线，或用最小二乘法原理建立各种肽的回归方程。

　　(3)取适量样品处理液进行色谱分析，得出样品色谱图。

　　(4)结果分析：根据色谱峰的保留时间定性，根据峰面积或峰高进行定量，求出样品中各肽的含量。

　　2.4大孔吸附树脂技术

　　大孔吸附树脂技术是上世纪七十年代发展起来的一种新工艺。它是一种具有多孔立体结构、人工合成的聚合物吸附剂，是在离子交换剂和其它吸附剂应用基础上发展起来的一类新型树脂，是依靠吸附剂和被吸附的分子(吸附质)之间的范德华引力，通过其巨大的比表面进行物理吸附而工作的。大孔吸附树脂是一类新型非离子型,高分子吸附剂，有较大的孔隙，孔径在8～25nm 范围，它们已被用于脱盐工艺，具有溶剂损耗小、操作简便、所得产品质量较好等优点[16]。目前，有不少大孔树脂纯化蛋白酶解物和多肽的实验报道，然而还存在许多问题，如工艺条件研究的规范性方法和技术要求等，但它仍有其他天然吸附剂不具备的优点，尤其是其孔径和孔度的大小、比表面积、极性等都可以人为控制，该方法操作简单，树脂价格便宜，易于再生，减少了生产成本。在天然活性物质的研究中应用前景广泛.南京师范大学潘道东等用DA201-C 大孔树脂对发酵乳中ACE 抑制肽进行脱盐研究，表明利用大孔吸附树脂进行脱盐，氮损失率较小，脱盐率高，并且不会造成ACE 抑制活性损失，大孔吸附树脂对ACE抑制肽有富集作用。在ACE 抑制肽的工业生产中，是一种可行的产品精制方法。为ACE 抑制肽的工业化生产奠定基础。

　　1)大孔吸附树脂的预处理[17]

　　树脂用无水乙醇浸泡24h，继续用无水乙醇洗至220nm 无吸收峰，然后再用去离子水洗净备用。然后用5%HCl 溶液洗涤，再用去离子水洗至中性，最后用2%的NaOH 溶液洗涤，再用去离子水洗至中性备用。 样品制备：水解液经100 ℃水浴10 min 灭酶，迅速冷却到40℃，lmol/LHcL调pH到4.6，冷却，然后8000r/min离心10min,低温离心。将离心后的上清液收集，再次8000r/min离心10min，将上清液通过截留分子量为6000D 的超滤膜，得到粗肽。 大孔吸附树脂静态吸附实验：在250ml 具塞锥形瓶中加入预先处理好的干树脂，无水乙醇充分溶胀，去离子水洗净无水乙醇;再加入粗肽溶液，放入25℃浴恒温振荡器中振荡，隔一定时间测定上清液的蛋白含量，计算吸附量和吸附率。 4.大孔吸附树脂静态解吸实验

　　选择乙醇为吸附剂对吸附ACE 抑制肽的树脂进行洗脱

　　5.大孔吸附树脂动态吸附和解吸实验：将处理过的大孔吸附树脂装入的层析柱中，在室温条件下，将pH2 的提取液上柱，用70% 的乙醇为洗脱剂，用紫外检测器于220nm 波长处检测流出液的吸光度(A220nm)，以A220nm=0.05 为透过点，收集洗脱峰，冷冻干燥。

　　6.肽含量的测定：取2.5ml 样品溶液，加入2.5ml 10% 的三氯乙酸水溶液与之混合反应，静置10min，在4000r/min 下离心15min，然后用缩脲法测定[18]。

　　结束语

　　以上简要介绍了近几年多肽物质分析方法及其进展。随着科学技术水平不断发展，会有许多更新的手段出现，因此这一研究领域具有广阔的前景。生物活性多肽的存在相当广泛, 关键是如何找到最佳的提取分离方法, 因而涉及它们的分离和分析问题也日益重要。

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