摘要：综述了近几年来乳肽物质的分析方法，主要包括色谱、超滤等方法.

　　关键词：乳蛋白肽，分析方法

　　Abstract：This paper reviewed analysis methods of milk protein peptide , which includes Chromatography 、ultrafiltration and so on.

　　Key words： milk protein peptide;Analytical methods

　　随着基因工程技术的发展，一些具有生物活性的小分子肽如抗菌肽[1]等受到高度重视。近几年来综述了生物活性肽的生理功能，其中包括许多具有在体内功能的特定氨基酸序列(2-6)。至今,人们已从乳蛋白中获得了多种生物活性肽,如阿片肽，抗菌肽和抗高血压肽，抗高血压肽由于具有显著的降低血压的功能,且具有安全、营养及保健等功能,是近几年来国内外研究的热点课题,也是功能性生物产品的一个重要的研究方向.目前,分离多肽的方法有很多,由于它的分子量较小,通常采用灵敏度比较高的分离方法,如离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、毛细管电泳、高效液相色谱方法、综合分离纯化的方法等等[7]。乳肽的检

　　测方法越来越趋于成熟，但对于乳肽的分离检测未见系统的介绍。

　　1.乳肽分离方法

　　1.1超滤技术

　　超滤是借助于人工合成的、具有选择透过性的膜，在常温下以膜两侧的压力差为推动力，基于物质能否透过膜或透过膜的速率不同，使液体中各组分得以分离、分级、提纯和富集的技术[8 ]。超滤被广泛用于分离蛋白水解液。借助超滤膜，可进行间歇式水解或连续水解，替代了传统方法的缺点，如，利用超滤技术具有形态不变，无需加热，设备简单，占地面积小，能耗低及操作压力低，操作过程中无相变化,不会改变产品的性能和活性。不用添加任何化学药剂，特别适用于热敏性物质，对不稳定产品是安全的，超滤处理量大，处理时间短，样品残留小，产品收率高等明显特点，能快速实现对产物的粗分(王湛，2000)。它不仅能提高水解反应的效率和肽得率，而且能够获取比较均一的目标肽段。

　　操作步骤：将优化组合的蛋白水解液为处理对象，取一定体积的蛋白水解液,用超纯水稀释，选用一定分子量的几种超滤膜(分别对应相应的标准分子量)。对蛋白水解液进行超滤处理，使粗肽依次按分子量大小分离为几个组分。超滤时，考虑膜通透量的影响，确定温度、时间、压力等。对超滤后不同分子量范围的蛋白水解物，分组收集，冷冻干燥后保存，以备下一步试验所用。

　　1.2透析法

　　操作步骤：选用一定的分子量范围的透析袋，将透析袋一端用夹子夹好，用漏斗在另一端将优化组合的蛋白水解液缓慢倒入袋内，不可装满，应留一半左右的空间，以防止透析袋在透析时被胀破或由于膨胀引起膜的孔径大小改变。装完经排气后扎好或夹住另一端，放在装有透析缓冲液的容器中，容器中应放一个电磁搅拌子，在电磁搅拌器的搅拌下进行透析。比膜分子量小的透析出来，可以达到所需分子量的肽。

　　1.3综合提取法

　　1)酪蛋白提取:根据酪蛋白性质最终确定其提取方法如下：在40℃水浴中用1mol/L的HCL调节鲜乳pH到4.6，此时出现大量酪蛋白沉淀，然后3500r/min离15min，收集沉淀和上清夜A，沉淀即为酪蛋白提取物。

　　2)乳清蛋白提取:根据乳清蛋白的性质最终确定其提取方案如下：将离心后的上清夜A收集，然后100℃煮沸20min，有沉淀析出，再次3500r/min离心15min，分别收集沉淀和上清夜B，沉淀即为乳清蛋白。

　　3)透析:将上清夜B装入截留分子量1,000Da的透析袋中对纯水透析，其中每2～3h换一次水。在透析时间上，分别进行了48h透析试验和24h透析试验，并通过电泳来分析透析时间对电泳结果的影响，结果显示，48h和24h电泳结果并无明显差异，所以为了节约时间，选定透析时间为24h。

　　4)浓缩:透析结束后得到非常稀的蛋白溶液，所以再用聚乙二醇6000浓缩，尽量浓缩，最后至原体积的1/5，收集备用，即为鲜乳中的小分子蛋白及多肽物质。

　　1.4沉淀法

　　Morr C V 等于1988 年报道了一种三氯乙酸(TCA)沉淀法[9]。首先将5%(W/V)的乳清粉溶解于12%(V/V)的三氯乙酸中，5000 × g 离心去沉淀保留上清，上清于截流3.5kD 的透析袋中用去离子水透析2d，所得上清液中含有酪蛋白糖巨肽。Saito T 等于1991 年报道了一种冷乙醇沉淀的技术方法生产酪蛋白糖巨肽[10]。首先将5%(W/V)的乳清溶液调整pH 值到3.5，溶液加热到98℃后并保持1h，迅速冷却至4℃用50% 的冷乙醇沉淀，再用1mol/L NaOH 调节pH 值至9.0，3000r/min 离心去沉淀保留上清，上清液中含有所需的酪蛋白糖巨肽。

　　2.乳肽分离纯化方法

　　2.1凝胶色谱法(gel chromatcgraphy, GC)

　　GC又称凝胶排阻色谱、分子筛层析和凝胶过滤等。使用的凝胶种类主要有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。使用过程中因其设备简单,重复性好,结果处理方便,因此应用非常广泛。

　　原理：这是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱法。当样品经凝胶层析后，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液和小分子量肽过，而大分子量肽则被阻挡在外。因此，大分子量的的在填料颗粒间隙中流动，比低分子量肽先下来，依次达到组分分离的目的。

　　步骤：1. 取己处理好的交联葡聚糖凝胶装柱，并用洗脱液洗脱处理2h 绘制标准曲线：选用不同已知相对分子量的标准品，溶解于lmL流动相中，进样20uL样品上柱于葡聚糖G-25柱，用流动相(pH=7.0，0.1mol/l的磷酸盐缓冲液)洗脱，每10min接1管(3mL)，在280nm测定其吸光度，并记录所收集溶液体积，分别测定它们的洗脱体积(Ve)或时间(t)，绘制吸光度-洗脱液体积曲线，这些参数存在一定的线性关系。并确定各种物质出现最大吸收峰时的洗脱体积(mL)。 取l.0ml样液在同样条件下洗脱，绘制洗脱曲线。由相应的洗脱峰体积与分子量对数作图。得到肽的分级图谱，能从上述关系中推测未知样品的各级分相对分子量分布范围。 2.2毛细管电泳法

　　电泳就是利用在电场作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质，以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离鉴定或提纯的技术。20世纪80年代发展起来的新毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，受到人们的充分重视。较其它分离方法，毛细管电泳有如下优点：高效，效率为105～106 板/m;快速，几十秒至十几分钟就可完成分离;微量，进样所需体积可小到1μl，消耗体积在1～50nl 之间;可通过选用不同的分离模式来适用不同的分离对象;经济，操作费用低;洁净，通常使用水溶液，对环境无害;自动化程度较高等。

　　操作步骤：分别称取少量多肽分子量标准品、水解液冻干粉加入适量缓冲液(100 mmoL/L Tris/HCl+O.1%SDS+O.1%PEO.pH 8.5)，沸水浴中加热溶解，离心分离，取上清液

　　经0.45μm滤膜过滤，超声脱气后在缓冲溶液中运行，于毛细管电泳中进样分析。

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