5. PepT1的克隆与特性

　　肽转运蛋白是质子藕联寡肽超级家族(也叫肽转运蛋白家族)中的成员[33]。表1总结了目前已分析鉴定出来的肽转运蛋白。第一个PepT1 mRNA是Fei等[2]通过把兔小肠分离出来的mRNA微注入到爪蟾卵母细胞中克隆得到，经分析预测，它由12个跨膜域(TMD)组成。Matthews等[19]把绵羊网胃上皮细胞RNA微注入到爪蟾卵母细胞并编码表达了肽转运蛋白。他们发现，Gly-Sar的吸收具有饱和机制(Kt=0.4mmol)，肌肽、甲二磺酰甘氨酸和甘氨酰亮氨酸对其有抑制作用，抑制率分别是44%、94%和91%，但不受游离甘氨酸的影响。Pan等[34]进一步研究了绵羊网胃上皮细胞RNA是否编码表达肽转运蛋白，结论与Matthews等[19]一致。

　　表1 质子依赖型寡肽转运蛋白家族 名称 别名 底物 转运类型和藕联离子 组织分布和细胞表达 PePT1 寡肽转运白1

　　或H+肽转运蛋白1 二肽和三肽质子 协同转运，H+ 小肠，肾顶膜，

　　溶酶体膜 PePT2 寡肽转运白2

　　或H+肽转运蛋白2 二肽和三肽质子 协同转运，H+ 肾，肺，脑，乳腺

　　支气管上皮细胞 PePT3 肽/组氨酸转运白2

　　或人肽转运蛋白3或PHT2 组氨酸，二肽和三肽质子 协同转运，H+ 肺，脾，胸腺，脑，肝，肾小腺，心脏 PePT4 肽/组氨酸转运白1

　　或人肽转运蛋白4或PHT1 组氨酸，二肽和三肽质子 协同转运，H+ 脑，视网膜，胎盘 此外，PepT1除在鼠、鸡、火鸡、狗、人、猪、牛、猴、鳕、斑马鱼等许多脊椎动物上克隆得到外(表2)，也在细菌、酵母、植物和无脊椎动物上发现，其氨基酸组成数量从707～729不等。近年来发现，原核H+依赖性肽转蛋白—YdgR的结构特征与哺乳动物的PepT1非常相似[35]

　　表2 几种动物小肠肽转运蛋白的克隆比较 种 类 cDNA AA数目 基因库 来 源 兔 2746 707 U06467(NM-001082337) Boll等[36] 绵羊 2829 707 AY027496(NM-001009758) Pan等[37] 人 3104 708 U21936(NM-005073) Liang等[38] 猪 2698 708 AY180903(NM-214347) Klang等[39] 食蟹猴 2127 708 AY289936 Zhang等[40] 猕猴 3108 708 AY289934 Zhang等[40] 鼠(mouse) 3128 709 AF205540(NM-053079) Fei等[41] 耗子(rat) 3032 710 D50664(NM-057121) Saito等[42] 鸡 2914 714 AY029615(NM-204365) Chen等[43] 火鸡 2921 714 AY157977 Van等[44] 斑马鱼 2636 718 AY300011 Verri等[45] 鳕鱼 2838 729 AY921634 Ronnestad等[46] 6. PepT1的底物特异性

　　PepT1可以转运400种二肽和8000种三肽。在PepT1的底物结合区域，水可屏蔽氨基酸侧链的质荷，因此，水被认为在PepT1的广泛特异性上具有重要作用(Daniel等，2004)。此外，Zn2+、Mn2+和Cu2+等金属离子也能与肽转运蛋白相互作用，从而加强肽的吸收[47]。

　　肽的转运具有质子依赖性。这一结论通过将PepT1 cRNA注入卵母细胞，然后用微电极电压钳技术检测了Gly-Sar吸收的H+电流得到证实[37,39,43,44,48]。PepT1转运的中性和阳离子氨基酸的适宜质子底物比率是1，而阴离子氨基酸的适宜质子底物比率是2。肽和H+被PepT1吸收后，H+在刷状缘囊膜通过Na+/H+交换运出细胞，反过来，在基底膜上Na+通过Na+/K+ATP酶带出细胞，3个 Na+交换2个K+，最终恢复电化学梯度。用爪蟾卵母细胞研究发现，绵羊[37]、兔[49]和人类[50]的PepT1偏爱pH5.5～6.0、中性和酸性肽。鸡的PepT1在pH6和6.5的环境中对[3H]-Gly-Sar的吸收运输效率比在pH5.0、5.5、7.0和7.5的环境中大[33]。

　　Vig等[51]比较研究了PepT1的底物特异性和结构特征。他以Gly-Sar作参考底物，用 MDCK细胞对73种肽(大多是二肽)进行了测定研究，结果表明，所有的二肽和三肽都是PepT1的底物。他推断，N-端疏水性氨基酸能加强PepT1的活性，中性氨基酸是PepT1的更好底物，另外，芳香性氨基酸也能加强PepT1的活性，实验中Trp-Trp不能被PepT1运输的原因是二肽的总体积超过了PepT1蛋白的总容纳能力。

　　Terada等[52]研究发现，半数的PepT1的N-端有TMD，该区域的1～6位包含有与pH变化相关的氨基酸残基。然而，C-端TMD中的7～9位被认为在决定底物亲和力上起重要作用[53]。His残基是肽转运蛋白底物键合区域中相当重要的残基。Meredith等[54]用组氨酸修改剂—焦碳酸二乙酯对肾刷状缘膜囊泡进行预处理后研究表明，PepT1失去了肽转运能力。对人类的PepT1 His-57[55]、鼠的PepT1 His-57和His-121[56]、以及兔的PepT1 His-57[57]进行诱变研究都发现肽转运蛋白的活性降低或失去。但用免疫染色研究表明，质膜上的肽转运蛋白数量并没有受到His-57或His-121诱变的损伤[55]。所有的结果指示，His诱变是蛋白质功能受到损伤，而不是蛋白质的生产。Chen等[57]还报道，兔的PepT1 His-121诱变后，对阴离子底物亲和力显著下降，于是他认为，His-57对H+至关重要。Doring等[58]报道，兔的PepT1 氨基酸残基的1～59位是底物键合域的重要部分，60～91位的氨基酸残基是肽吸收侧面与pH相关的重要部分。这与Bolger等[59]的研究一致。

　　另外，还有其它一些结构特征影响肽转运蛋白的活性。与包含有氨基酸D-异构体的肽转运蛋白相比，氨基酸 L-异构体肽转运蛋白对底物肽的亲和力更强[60]。Terada等[61]研究报道，与对应体Gly-Gly和Met-Ala相比，N-甲基-Gly-Gly和N-甲酸基-Met-Ala对PepT1的亲和力降低。

　　7. 结语

　　总之，小肽具有游离氨基酸不替代的生理作用，尤其对乳蛋白的合成更是举足轻重。肽转运蛋白是小肽吸收转运的重要载体，那么，它在机体组织和细胞中的分布如何?日粮、激素、生长发育和疾病对肽转运蛋的表达与分布有什么影响?小肽吸收的替代途径具体怎样吸收转运寡肽?敬请继续关注。

　　参考文献

　　[1] Matthews, D. M. Protein Absorption: Development and Present State of the Subject[C]. Wiley-Liss, New York, NY.1991,126～137.

　　[2] Fei, Y. J., Y. Kanai, S. Nussberger etal. Expression cloning of a mammalian proton-coupled oligopeptide transporter[J].Nature,1994,368:563～566.

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