【分　 类】 基础科学
【关 键 词】 DTT   水解  大豆胰蛋白酶抑制剂
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正文：
【摘要】大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)可以抑制一些来源于动物或植物的蛋白酶的活力，使之降低水解蛋白质的效力，降低蛋白质的利用率。本文主要选取二巯基苏糖醇（DTT）采用分光光度法、SDS-PAGE和GPC色谱法相结合测定DTT对大豆胰蛋白酶抑制剂的水解程度进行研究。
【关键词】DTT   水解  大豆胰蛋白酶抑制剂
Study on the soja parenzyme depressor hydrolyze by DTT
Abstract:The soybean trypsin inhibitor (STI) may inhibit some from animal or plant protease energy, so that to reduce the effect of hydrolysis of protein to reduce protein utilization. In this paper, selected dimercapto Chisu sugar alcohols (DTT) using spectrophotometry, SDS-PAGE, and the Combination of GPC chromatographic determination of DTT to large Soybean trypsin inhibitor to study the extent of hydrolysis.
Keywords:DTT hydrolysis soybean trypsin inhibitor
大豆蛋白是人类最主要的植物蛋白质来源，但豆类植物在提供丰富营养的蛋白质资源的同时，又广泛存在着各类营养限制性因子，其中STI就是其中之一。一些学者研究发现STI是导致大豆利用率下降的最根本的原因，它限制了人体和动物对豆类蛋白质的吸收和利用，STI分子内含有跨链的二硫键，使得STI结构稳定，耐热耐酸。许多植物STI的一个分子可以同时结合两分子的蛋白酶，这就造成了蛋白酶失去与蛋白质底物结合的机会，因此我们必须通过特定的方法除去或克服STI所带来的不利影响，才能充分利用豆类蛋白质资源。本文主要选择DTT对STI的水解作用，采用分光光度法、SDS-PAGE和GPC色谱法相结合，对STI的水解程度进行分析研究的。
1  实验材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要试剂
DTT溶液、TGase溶液、Tris-Hcl缓冲液(50moI/L，pH7.5)、大豆胰蛋白酶抑制剂溶液（5000BAEE/mL）、BAPNA溶液（0.4mg/mL）、胰蛋白酶溶液（5,000BAEE/mL）、30%(v/v)冰醋酸溶液、电泳试剂等
1.1.2主要仪器
电子分析天平、电子恒温水浴锅、PHS-25型酸度计、78-1型电磁搅拌器、752分光光度计、DY-III型电泳仪、Waters高效液相色谱仪、凝胶成像系统等。
1.2  实验方法
.1.2.1 DTT对STI的水解
DTT对STI的水解步骤如图l所示。
 

图1 DTT水解STI的方法
对照样为0.25ml大豆胰蛋白酶抑制剂加入1mL的TGase(1U/mL)，然后50℃水浴恒温8h后，100℃灭酶5min,反应液4℃储藏以备后用。
1.2.2采用分光光度法测定STI水解程度
实验方法如图2所示。

图2  测定DTT对STI的水解步骤
对照样为不经处理的STI原溶液，其余操作相同。用空白样做参比，分别取样液及对照样溶液，通过比较处理的STI与不经处理的STI原液反应的样品在410nm的吸光值，就可由残留的胰蛋白酶活性间接检测出DTT及TGase对STI的水解程度。
另外，用0.lmL胰蛋白酶溶液加上0.31mLTris-Hcl缓冲液，混匀后与2mLBAPNA溶液于75℃水浴反应15min，然后加入0.lmL30%冰醋酸中止反应，在410nm下比色，测定胰
蛋白酶的活力(A₄₁₀表示)。
当STI完水解时，胰蛋白酶表现出最高活力，这时反应液的吸光值最大，当STI未被水解时，胰蛋白酶表现出最低活力，这时反应液的吸光值最小，当STI部分钝化时，反应液的吸光值介于他们之间。因此，可用下式表示STI钝化的相对活力大小:
STI的相对失活（%）=（样液的A₄₁₀值－对照样的A₄₁₀值）／胰蛋白酶活力（A₄₁₀值）
1.2.3 SDS-PAGE分析
将STI与反应液进行SDS-PAGE分析，电泳胶按表l所列配制。
表1电泳胶试剂表

试剂	分离胶（12.5%）/mL	浓缩胶（3%）/mL
单体胶储备液 浓缩胶缓冲液 分离胶缓冲液 双蒸馏水 1%AP TEMED 总共	7.2 - 4.5 5.4 0.9 0.009 18	0.9   - 3.3 0.3 0.006 6

电泳样品分别为STI标样、DTT与STI反应液、DTT结合TGase与STI的反应液及TGase与STI的反应液。标样STI的浓度和水解反应中STI的浓度一样，反应液加入等体积的样品缓冲液，电泳时电流先取10mA，待样品完全进入分离胶后，改为20mA，电泳时间为6h。电泳结束后，凝胶用ρ(考马斯兰R-250)=2.5g/L染色，然后用标准低甲醇脱色液脱色，最后拍照保存。
1.2.4 GPC分析
1.2.4.1 GPC操作条件
色谱柱：Protein--Pak^TM60(7.8×300mm Column WATO85250);流动相：50mMTris-HCl的缓冲液(pH7.5);流速：0.6mL／min；柱温：20℃；进样量：10μL。
1.2.4.2 GPC样品预处理
将样品溶液与流动相溶液以l：1比例混合，用离心机以8000r／min离心20min后，取10μL注入色谱仪，进行GPC分析。
2实验结果及分析
2.1分光光度法测定STI水解的结果
测定实验结果见表2。
表2 BAPNA测定实验结果

样品	吸光值	STI的相对失活率%
对照样 胰蛋白酶 DTT钝化STI的反应液 DTT结合TGase钝化STI的反应液 TGase钝化STI的反应液 热处理STI反应液	0.006 0.735 0.591 0.670 0.111 0.094	-- -- 79.53 90.34 14.35 11.95

从表中可以看出，DTT单独处理和DTT与TGase酶结合处理均可不同程度的钝化STI，由于DTT的加入，与STI发生氧化还原反应，使得STI分子内部的二硫键被打断，但DTT并不能完全钝化大豆胰蛋白酶抑制剂，其原因可能是因为DTT并未把STI中的二硫键完全打开。但DTT和TGase酶结合处理时，TGase可以进一步聚合残存的还原态的STI,因此使STI失活程度更高些，使胰蛋白酶活力残存较高，能够与底物BAPNA生成较多的能在410nm处显色的物质，而热处理及TGase酶单独处理作用对STI钝化作用较小，使胰蛋白酶活力几乎失活，很少与底物BAPNA反应生成在410nm处显色的物质。
2.2 SDS-PAGE分析
电泳结果见图3。

图3 DTT水解大豆胰蛋白酶抑制剂的电泳照片
从电泳图带III和IV可以看出，热处理和TGase酶处理STI水解效果不大。带I和带II中残留STI部位特别是带I明显减少，说明STI被水解，得出DTT单独处理及DTT和TGase共同处理均可钝化STI活性。从带I和带II中还可看出，STI经这两种方法处理后均有大分子聚合物生成，并且带I生物聚合物含量大大增加，由于DTT处理后仍有一部分还原态STI残留，当加入TGase后，进一步聚合残存的还原态STI，因此聚合物含量增加。这就证明：DTT能使STI的分子结构发生改变，从而对STI具有一定的水解作用，其结果与比色法得出的结果相一致。

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