【摘要】 通过单因素和正交试验研究了超声波处理对桦褐孔菌中抗氧化活性物质提取效果的影响。结果表明各因素对提取效果的影响大小依次为：溶剂体积分数、超声处理时间、超声功率和液料比。最佳提取工艺为乙醇体积分数60%、超声处理时间30 min、超声功率为500 W、液料比30mL/g;在最佳条件下采用福林-酚法检测总多酚的提取质量比可达12.27 g/kg。超声波技术是一种有效的辅助提取天然产物中活性物质的方法。

　　关键词：桦褐孔菌 超声波辅助提取 抗氧化活性 总多酚

　　引言

　　桦褐孔菌(Inonotus Obliquus)是生长在俄罗斯北部、中国吉林省长白山及日本北海道等寒冷地区的白桦树上的一种特殊的真菌[1, 2]。研究表明，桦褐孔菌中含有较多的生物活性成分，具有抗肿瘤、增强机体免疫力、降血糖等功效[3, 4]。所以其防病机理和保健功能已成为研究热点。近年来，人们开始着力研究桦褐孔菌的抗氧化活性，高愿军等[5]报道桦褐孔菌中的抗氧化物质为多酚化合物。目前抗氧化活性物质的提取主要采用溶剂浸出法和溶剂回流提取法，这些方法操作繁琐、提取率低。超声波技术作为一种有效的提取方法，已经应用于天然产物的提取研究[6]。

　　本试验将超声波技术应用到桦褐孔菌抗氧化活性物质的提取工艺中。因桦褐孔菌中的抗氧化主要成分还没确定，故采用DPPH自由基清除率作为评价指标。试验结果将为桦褐孔菌抗氧化活性物质的分离纯化奠定理论基础。

　　1材料与方法

　　1.1 材料和仪器设备

　　桦褐孔菌子实体：采自我国吉林省长白山地区，由吉林省延边真菌研究所提供。40℃下烘干、粉碎、过200目筛待用。JY92-2D型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，FW177型中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)，BS224S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，D66-101-l 型电热鼓风干燥箱(天津天宇机电有限公司)，Primo高速离心机(Heraeus公司)，RE-3000A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)购自Sigma公司，其余试剂为国产分析纯。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1传统提取法

　　称取桦褐孔菌子实体经粉碎后过40目筛，准确称取干粉10.0g于圆底烧瓶中，加提取溶剂60%乙醇200mL，在80℃下提取3h，然后将固体物质过滤除去，将提取液减压浓缩至2mL 左右，定容至5mL 待测。

　　1.2.2超声波辅助提取法

　　1.2.2.1超声波辅助提取的单因素试验

　　称取10.0g桦褐孔菌子实体干粉，加入提取溶剂，在具塞锥形瓶中将干粉与溶剂混合均匀后,将烧杯放在超声波细胞粉碎机处理室中进行提取。以溶剂体积分数、超声功率、超声处理时间、液料比做单因素提取试验(见表1)，将处理后的固体物质过滤除去，将提取液旋转蒸发浓缩至2mL左右，定容至5mL。

　　DPPH自由基[15]被广泛用于评价抗氧化剂清除自由基的能力。因桦褐孔菌中的抗氧化活性物质还未确定，所以通过测定提取液的DPPH自由基清除率评价提取液的抗氧化活性，间接反应抗氧化活性物质的提取得率。

　　表1单因素试验设计

　　Tab.1 Design of Single factor experiments 因素factor 水平level 提取条件extracting condition 溶剂体积分数% 0、20、40、60、80、100 料液比20、提取30 min、500W

　　超声功率/W 100、200、300、400、500、600 液料比20、提取30 min、60%乙醇

　　超声时间/t 10、20、30、40、50 、60液料比20、60%乙醇、500W

　　液料比(mL/g) 5、10、20、30、40、50提取30 min、500W、60%乙醇 1.2.2.2超声波提取的正交试验

　　以单因素试验结果为参考，设计四因素三水平(L9(34))的正交试验，其因素水平如表2所示，三次重复，以提取液的DPPH自由基清除率表示桦褐孔菌提取物抗氧化物质含量的高低。

　　表2 正交试验因素水平设计

　　Tab.2 Design of 0rthogonal experiments 水平 因素 溶剂体积分数A

　　/ % 处理时间B

　　/min 液料比C

　　/mL/g 超声功率D

　　/W 1 40 20 10 300 2 60 30 20 400 3 80 40 30 500 1.3测定方法

　　1.3.1 DPPH自由基清除率的测定

　　采用Yamaguchi等[7方法，取0.2mL的样液同1.0mL 95%的DPPH乙醇溶液混匀，于37℃反应60min后在517nm处比色。DPPH自由基清除率用下方程式计算:

　　Y=(OD517对照- OD517样品)/ OD517对照×100

　　(Y—抑制率，%;OD517对照—517 nm下对照品的吸光度值;OD517样品—517 nm下不同浓度样品的吸光度值)

　　1.3.2多酚含量测定

　　参照Jayaprakasha等[8]方法。

　　2 结果与讨论

　　2.1 单因素试验结果与分析

　　2.1.1溶剂体积分数

　　从图1可知，在乙醇体积分数小于60%时，提取液的DPPH自由基清除率随溶剂体积分数增大而增大，当乙醇体积分数超过60%以后呈下降趋势，说明乙醇体积分数过高或过低提取效果都不佳。这是由于不同体积分数的乙醇极性不同，多酚类化合物具有较高的极性。根据相似相溶原理，本试验选择乙醇体积分数40%、60%和80%设计正交试验。

　　图1 溶剂体积分数对提取效果的影响 图2 超声处理时间对提取效果的影响

　　Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate Fig. 2 Effect of ultrasonic processing time on extraction rate

　　2.1.2超声处理时间

　　超声处理时间对桦褐孔菌抗氧化活性物质提取效果的影响见图2所示。在超声波功率等其他因素固定的条件下，超声处理时间越长，超声波对物料的作用越充分，抗氧化活性物质浸出越多，DPPH自由基清除率就越高。但处理30 min后，DPPH自由基清除率增高趋于缓慢，可见超声波能在较短时间内对物料进行充分提取，超声波提取具有省时的优点。试验选取20、30、40 min三个处理时间做正交试验。

　　2.1.3液料比

　　如图3所示，随着液料比的增大，提取液的DPPH自由基清除率相应增高。液料比达到20mL/g以后，DPPH自由基清除率增加趋于平缓。从提取效率和节省溶剂角度综合考虑，选液料比10、20、30 mL/g三个水平做正交试验。

　　2.1.4超声功率

　　超声波的功率越大越容易获得较高的声强，超声强度对提取率的影响不能一概而论,要考虑超声波与介质相互作用的程度和提取物的性质。由图4可以看出，随着超声功率的提高，提取液的DPPH自由基清除率呈逐渐上升趋势;但当超声功率超过400 W时，提取液的DPPH自由基清除率升高变得缓慢，因而确定300、400、500 W三个功率做正交试验。

　　图3 液料比对提取效果的影响 图 4 超声功率对提取效果的影响

　　Fig. 3 Effect of ratio of solvent to solid on extraction rate Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate

2.2　正交试验结果与分析

　　根据单因素试验结果，选定溶剂体积分数、超声处理时间、液料比、超声功率进行四因素三水平的正交试验，试验结果如表3所示。

　　根据表3的极差分析结果可知，四种提取因素中对抗氧化物质提取效果影响从大到小重要性排序依次为：A﹥B﹥D﹥C，即：溶剂体积分数﹥超声处理时间﹥超声功率﹥液料比;最佳超声辅助提取工艺组合为A2B2D3C3，即乙醇体积分数60%、超声处理时间30 min、超声功率500 W和液料比30 mL/g。最优组合并未出现在正交表中，对最优组合A2B2D3C3进行3次验证试验，测定提取液的DPPH自由基清除率，计算平均值，DPPH自由基清除率为75.39%± 1.28%。

　　表3桦褐孔菌抗氧化物质提取的正交试验

　　Tab.3 Orthogonal experiments for extracting antioxidants from Inonotus Obliquus 试验号 因素 DPPH自由基清除率/% A B C D 1 1 1 1 1 58.35 2 1 2 2 2 68.38 3 1 3 3 3 69.46 4 2 1 2 3 71.23 5 2 2 3 1 74.39 6 2 3 1 2 75.88 7 3 1 3 2 64.12 8 3 2 1 3 72.56 9 3 3 2 1 66.36 K1 65.397 64.567 68.930 66.367 K2 73.833 71.777 68.657 69.460 K3 67.680 70.567 69.323 71.083 极差R 8.436 7.210 0.666 4.716 优方案 A2 B2 C3 D3

　　2.3 超声辅助提取法与溶剂回流提取法的比较

　　溶剂回流提取最佳工艺条件为：乙醇浓度60%、提取温度80℃、液料比20mL/g和提取时间3h[9];超声辅助提取最佳工艺条件为：乙醇浓度60%、超声处理时间30min、液料比30 mL/g、超声功率500 W。在最佳工艺条件下，比较两种提取方法对桦褐孔菌抗氧化活性物质的提取效果。试验结果如表4所示:采用超声辅助提取方法，提取液的DPPH自由基清除率显著高于传统提取方法，总多酚提取质量比具有显著差异性。说明采用超声辅助提取技术既缩短了提取时间，又提高了提取率。

　　表 4 超声波辅助提取与溶剂回流提取法的比较

　　Tab.4 Comparison of ultrasonic extraction and traditional extracting method 提取方法 DPPH自由基清除率% 总多酚提取质量比g/kg 溶剂回流浸提法 68.67± 1.12b 8.89± 0.93b 超声辅助提取法 75.39± 1.28a 12.27± 0.38a 3　结论

　　(1)采用超声波辅助提取桦褐孔菌抗氧化活性物质，优化得到最佳工艺条件:提取时间30 min、液料比30 mL/g、乙醇浓度60%、超声功率500W。在此工艺条件下，桦褐孔菌总多酚提取质量比为12.27 g/kg。

　　(2) 与溶剂回流提取法相比较，在提取温度、提取时间、DPPH自由基清除率、抗氧化活性物质提取质量比等方面具有一定的优势，是一种有效的抗氧化活性物质提取方法。

　　参考文献

　　[1]M.Ya.Shashkina,P.N.Shashkin,A.V.Sergeev.Chemical and Medicobiological Properties of Chaga[J].Pharmaceutical Chemistry Journal,2006,40(10):560-568.

　　[2] 张慧丽，靳宝峰，李辉，等. 桦褐孔菌酸奶的工艺及药用功能的研究[J].饮料工业，2006,9 (5):24-25.

　　[3]Kahlos K, Kangas L, Hiltunen R. Antitumor activity of some compounds and fractions from an n-hexane extract of Inonotus obliquus[ J ]. Acta Pharmfenn, 1987 (96) : 33-40.

　　[4Rzymowska J.The effect of aqueous extracts from Inonotus obliquus on the mitotic index and enzyme activities[J].Boll Chim Farm,1998,137(1)：13-15.

　　[5高愿军,高雪丽，吴广辉，等.桦褐孔菌抗氧化活性的稳定性研究[J].食品研究与开发，2007,28(4):77-80.

　　[6] 杨喜花，陈敏，朱蕾，等.超声循环提取沙棘叶中总黄酮的研究[J].农业机械学报，2006, 37(3): 166-168.

　　[7]Yamaguchi T, Takamura H, Matoba T, et al. HPLC method for evaluation of the free radical-scavenging activity of foods by using 1,1,-diphenyl-2-picrylhydrazyl[J].Bioscience Biotechnology Biochemistry,1998,62(6):1201-1204.

　　[8] JayaprakashaG K, SinghRP, SakariahK K. Antioxidant activity of grape seed (Vitis vinefera) extracts on peroxidation models in vitro[J]. Food Chemistry, 2001,73：285-290.

　　[9] 梁丽雅，张泽生，吕晨，等. 桦褐孔菌抗氧化活性物质的提取工艺研究[J].食品研究与开发，2009，30(4)：34-37.