摘要：本试验采用3×3拉丁方设计，在日粮中添加0%(对照组)、1.5%(处理1)、3%(处理2)的缩合单宁对牛进行饲喂试验。研究其对瘤胃挥发性脂肪酸含量及微生物生长的影响。由试验结果可知：添加3%的缩合单宁可显著降低瘤胃蛋白质降解细菌的数量，并能显著增加量乙酸的含量。

　　关键词：缩合单宁;瘤胃细菌;挥发性脂肪酸

　

　　随着对反刍动物蛋白质营养研究的不断深入与发展，人们发现仅仅依靠微生物合成蛋白质，为反刍动物提供氮源已经不能满足其营养需要。因此，怎样提高饲料中蛋白质的利用率成为现在研究的热点。Molan等(2001)[1]研究发现400 mg/ml或更高浓度的缩合单宁能抑制瘤胃许多种细菌的生长，证明缩合单宁可以影响瘤胃挥发性脂肪酸的含量。但是缩合单宁也有危害性，Silanikove等(1996)[2]研究发现采食过多或经常采食富含单宁的饲料会引起反刍动物中毒，损伤肝、肾等组织。本试验主要是选用榛子叶缩合单宁，通过体内法研究不同浓度的缩合单宁对反刍动物瘤胃挥发性脂肪酸含量及微生物生长的影响，为缩合单宁在反刍动物的营养应用提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验设计

　　采用3×3拉丁方设计。对照组、处理1和处理2组分别添加0%、1.5%和3%的缩合单宁。

　　1.2 缩合单宁的获取

　　试验用的缩合单宁是采集野生的榛子树叶，经过自然干燥。应用Porter等[3]研究的方法对缩合单宁进行提取。

　　1.3 试验动物及管理

　　试验在延边大学农学院牧场进行，选择3只体重为(300±20 Kg)安装永久瘤胃瘘管的延边黄牛，供采集瘤胃液使用。试验牛每日于早上08：00和18：00饲喂等量的饲料，自由饮水并正常驱虫。饲粮是根据美国NRC(1996)标准配制成。配方及营养水平见表1.1。

　　表1.1 供试牛日粮配方及营养水平

　　Table 1.1 Composition and nutrient level (%) of concentrate

　　组分(Ingredients)

　　百分比

　　营养水平 (Nutrient Level)

　　玉米(Corn)

　　42.44

　　肉牛综合净能(RND)

　　42.51

　　麦麸(Soybean meal)

　　2.66

　　粗蛋白(CP)

　　18.53

　　豆粕(Rice bran)

　　7.93

　　粗脂肪(EE)

　　5.80

　　食盐(Salt)

　　0.50

　　粗纤维(CF)

　　13.07

　　预混料添加剂(Additive)

　　1.00

　　粗灰分(Ash)

　　4.67

　　玉米青贮(Corn silage)

　　34.99

　　钙(Ca)

　　0.36

　　紫花苜蓿(sativa)

　　5.01

　　磷(P)

　　0.17

　　注：表中各个物质的量以干物质为基础。

　　1.4 测定项目及方法

　　1.4.1 PH值测定

　　用PHS-3C型酸度计进行测定。

　　1.4.2 挥发性脂肪酸(VFA)的测定

　　将装有瘤胃液的离心管从-25℃冰箱中取出，使样品缓慢地解冻，取上清液0.4ml，加入0.2ml25%偏磷酸溶液(含内标2-乙基丁酸)，振荡混合均匀，冰浴30min以上，10000rpm，4℃下离心10min，取上清液，用HP6890气相色谱仪测定总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸的含量。

　　气相色谱条件：

　　色谱柱：HP1909IN-213 最高使用温度为260℃，HP-INNOWAX Polyethylene Glycol;毛细管30m×320um×0.50um;载气：氮气，流速为2ml/min;柱箱温度：程序升温，50℃(0.5min)至120℃(6min)此期以每分钟30℃的速度升温，再升温至220℃，保持3min，期间以30℃/min的速率升温;进样量：1ul，进样口温度为200℃;检测器：FID检测器，温度为250℃。

　　1.4.3 细菌数量的测定

　　通过厌氧培养法，并以菌落总数分析仪进行测定。

　　1.5 数据统计

　　试验数据先用Excel进行处理,再采用spass软件(spass 11.5 for windows)中单因素方差分析过程(one-Way ANOVA)进行统计，均值的多重比较采用其中的LSD法进行分析。试验数据用平均数±标准误差表示。

　　2 结果与分析

　　2.1 缩合单宁对瘤胃pH值的影响

　　图2.1瘤胃液pH值的变化

　　Fig. 2.1 Changes of pH in rumen

　　由图2.1可见，各组的pH值呈先下降后上升的趋势，在采食3小时后各组的pH值最小，之后逐渐回升到初始状态。但处理组各个时间点pH值较高，对照组和处理1、处理2之间差异不显著(p>0.05)。但随着缩合单宁含量的添加量的增加，pH值呈上升的趋势。

　　2.2 缩合单宁对瘤胃细菌的影响

　　表2.1瘤胃内细菌的变化(单位：CFU/ml))

　　Table 2.1 Changes of rumen bacteria in rumen

　　项目

　　对照组

　　处理1

　　处理2

　　蛋白质降解细菌(×108CFU/ml)

　　9.97±1.89a

　　5.94±0.87b

　　5.61±0.33b

　　纤维素降解细菌(×107CFU/ml)

　　5.56±1.45

　　3.87±0.67

　　3.54±0.36

　　淀粉降解细菌(×108CFU/ml)

　　11.51±1.23

　　10.69±0.71

　　10.22±1.02

　　总活菌(×109CFU/ml)

　　7.85±1.15

　　6.43±0.88

　　6.14±0.95

　　注：同行不同字母表示差异显著(P<0.05)。

　　由表2.1可见，处理组的蛋白质降解细菌的含量显著低于对照组(P<0.05);处理组纤维素降解细菌数、淀粉降解细菌数、总活菌数均低于对照组，但各组之间差异不显著(P>0.05)。

　　2.3 缩合单宁对瘤胃液挥发性脂肪酸的影响

　　图2.2 TVFA浓度变化 图2.3 乙酸浓度变化

　　Fig. 2.2 Changes of TVFA concentration in rumen Fig. 2.3 Changes of acetate concentration in rumen

　　图2.4 丙酸浓度变化 图2.5 丁酸浓度变化

　　Fig. 2.4 Changes of propionate concentration in rumen Fig. 2.5 Changes of butyrate concentration in rumen

　　图2.6 乙酸/丙酸的变化趋势

　　Fig. 2.6 Changes of A/P in rumen

　　由图2.2可以看出对于总挥发性脂肪酸的浓度，总的变化范围在83.95～67.69 mmol/100ml之间，各组变化趋势都一致，均在下次饲喂前达到最低值，饲喂后3h达到最大值。

　　乙酸浓度的变化，从图2.3可见，各个组均呈先上升后下降得趋势。在3h时处理1达到最大值。6h时照组、处理2达到最大值。之后逐渐下降。切对照组一直处于较高趋势。但个个时间点各个组差异不显著(p>0.05)。

　　丙酸浓度的变化，从图2.4可见，各组呈先上升后下降的趋势，在3h时各组达到最大值，之后逐渐下降。处理2在各个时间点均显著高于对照组(P<0.05)。说明添加高浓度的缩合单宁能提高丙酸的含量。

　　丁酸浓度的变化，由图2.5可见，各组呈先上升后下降的趋势，在3小时时各组达到最大值。且各个时间点各组之间差异不显著(p>0.05)，但处理2组在个时间点较高。

　　乙酸与丙酸的比值变化，从图2.6可见，各组呈先下降后上升的趋势。对照组的乙酸与丙酸的比值一直处于最高，处理组均低于对照组，但各处理组间在各个时间点差异均不显著(p>0.05)。

　　3 讨论

　　3.1 缩合单宁对瘤胃液pH值的影响

　　pH值是反映瘤胃发酵水平的一项重要指标，综合反映瘤胃微生物、代谢产物有机酸产生、吸收、排除及中和状况。它直接受唾液分泌、挥发性脂肪酸及其他有机酸生成、吸收和排出等诸多因素的影响。引起瘤胃pH值波动的根本原因则是日粮结构和日粮营养(Reddy,1987)[4]。韩正康等(1988)[5]报道pH值一般在饲喂后2-6h达到最低值。Kopecny和Wallace(1982) [6]建议适合瘤胃微生物蛋白水解酶活性作用的pH为5.5-7.0。

　　本试验中，各处理组的瘤胃液pH值在5.66-6.87之间变化变动，在正常范围内变化。也基本保持在有利于瘤胃微生物正常活动的范围内。但处理组随着缩合单宁添加量的增加其pH值呈上升趋势。李晓鹏(2009)[7]利用体外法，研究不同浓度的银合欢缩合单宁对瘤胃发酵的影响，发现pH值随着所缩合单宁添加量的增加而呈上升趋势。但差异显著(p>0.05)。本试验与其结果一致。

　　3.2 缩合单宁对瘤胃细菌的影响

　　瘤胃微细菌的生长受到很多因素的影响，饲料的日粮组成起到主要作用，本实验中饲料的日粮组成相同，所以对微生物影响的主要是缩合单宁的量，一方面由于缩合单宁与蛋白质结合，使底物发酵减弱，所以微生物生长的营养物质减少，从而影响了微生物的数量。另一方面由于日粮中的缩合单宁甚至可以引起多种细菌解剖结构的改变。

　　从试验结果可以看出，添加缩合单宁对瘤胃的蛋白质降解细菌影响最大，当添加量达到3%时蛋白质降解细菌生长受到显著影响。纤维素降解细菌和淀粉降解细菌及总活菌影响较小。这说明当添加3%的缩合单宁时可以抑制蛋白质降解细菌生长，并不影响其它细菌。Molan等(2003)[8]研究也证实了这一点，他发现400mg/mL或更高浓度的缩合单宁能抑制瘤胃许多种细菌的生长。Min等(2005)[9]报道，绵羊由多年生黑麦草和白苜蓿。转向 corniculatus(干物质中缩合单宁含量为32g/kg)为主日粮时，1mL瘤胃蛋白质分解菌Clostridium prote-oclasticum B316，Eubacteriumsp.C12b，Streptococcus bovis B315 和Butyrivibriofibrisolvens C211a等蛋白质降解细菌出现显著下降。利用缩合单宁对瘤胃蛋白质降解细菌的影响，可以减少饲料蛋白质在瘤胃内的降解。从而增加过瘤胃蛋白的含量。

　　3.3 缩合单宁对瘤胃VFA浓度的影响

　　碳水化合物发酵的主要产物为乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，它们是反刍动物主要的能量来源及合成乳脂和体脂的原料。Gray等(1992)[10]认为，反刍动物的消化能约60-80%由瘤胃VFA提供。VFA很大程度上影响瘤胃pH值，而反过来瘤胃pH值对瘤胃微生物群落也有重要影响。乙酸、丙酸、丁酸浓度的相对比例不仅受反刍动物采食水平的影响，而且也受日粮组成等因素的影响。

　　本试验中，日粮中添加不同浓度的缩合单宁对乙、丙、丁酸和总VFA浓度的变化随着时间点的不同表现相似的变化规律，即采食2～4h后出现峰值然后下降，这主要是因为采食后瘤胃内快速发酵产生大量的乙、丙和丁酸，随着时间的推移，瘤胃微生物对其利用以及瘤胃壁对其吸收，使VFA浓度下降所致。而且，这一结果与本试验中观察到的pH值在这一时间段出现最低值相吻合。

　　Silankove[11]等的试验中，用含缩合单宁的，白坚木、栎树、角豆树等饲喂发现，瘤胃液中挥发性脂肪酸浓度降低(P>0.05)。Ngamsaeng [12]等用体外法研究多种植物的发酵情况，结果发现缩合单宁含量对总挥发性脂肪酸与各种酸的产量均有显著影响(p<0.05)。缩合单宁含量高的植物其丙酸含量显著增高(p<0.05)。TVFA和乙酸显著降低(p<0.05)。本试验中，各组间总挥发性脂肪酸、乙酸、丁酸差异不显著(p>0.05)。但缩合单宁含量较高组均较对照组低，可能是由于缩合单宁的种类和缩合单宁含量关系，所以差异不显著(P>0.05);丙酸处理2组显著高于对照组(p<0.05)。与以上的研究结果一致。丙酸发酵时可以利用氢 ，所以丙酸的比例增高时增加饲料能量的利用率[13]。

　　4 结论

　　1.在本试验条件下添加3%的榛子叶缩合单宁对瘤胃pH值、TVFA、乙酸、丁酸无显著影响。但能显著增加丙酸的含量。可见缩合单宁能够增加饲料能量的利用率

　　2.在本试验条件下添加3%的榛子叶缩合单宁显著降低蛋白质降解细菌的数目。但对其他细菌无显著影响。这有利于增加过瘤胃蛋白的量。

　　参考文献

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　　[2] Silanikove N, Gilboa N, Perevolotsky A, et al. Goats fed tannin-containing leaves do not exhibit toxic syndrome [J]. Small Ruminant Research, 1996, 21:195-201.

　　[3] Brskov E R, Jones M H, et al. Degradability of protein by supplement and utilization of undegraded protein high-producing dairy cows [J].Recent Advances in Anim Sci,1994,85

　　[4] Reddy K J, Reddy M R. Effects of eedingeom Plete feeds on various nitrogen fractions and total VFA eoneentrations in the rumen fiuid of sheep [J]. Indian Joumal of Animal Seience,1993,55(9):81.

　　[5] 韩正康,陈杰.反刍动物瘤胃的消化和代谢科学出版社[M].1988

　　[6] Kopecny, J. Wallace. Cellular location and some properties of proteolytic enzymes of rumen bacteria [J]. Appl Environ Microbiol,1982,43:1026-1033.

　　[7] 李晓鹏.缩合单宁对体外发酵特性的影响[D].甘肃:甘肃农业大学,2009

　　[8] Molan A I.Effects of condensed tannins and crude sesquiterpene lactones extracted from chicory on the motility of larvae of deer lungworm and gastroin-testinal nematodes[J].Parasitology International,2003(52):209-218

　　[9] Min B R, McNabb W C. The effect of condensed tannins from Lotus corniculatus on the proteolytic activities and growth of rumen bacteria[J]. Animal Feed Science and Technology,2005,121,45-58

　　[10] Gray, G M. Starch digestion and absorption in nonruminants [J]. Nutr.Jan,1992,122(1):172–177.

　　[11] Slianikove N, Perevotsky A. et al. Use of tannin-binding chemicals to assay for tannins and their negative postingestive effects in ruminats [J]. Animal Feed Science and Technology,2001,91:69-81

　　[12] Ngamsaeng A, Wanapat M. et al. Evaluation of local tropical plants by in vitro rumen fermention and their effects on fermentation endproducts [J]. Pakistan Journal of Nutrition,2006,5(5):414-418

　　[13] 杨凤,周国安等.动物营养学[M].北京:中国农业出版社,2004