摘 要：为解决分散型醇法大豆浓缩蛋白苦味重、色泽深、含盐量高等缺点，本试验采用活性炭粉末脱色脱苦，透析袋脱盐，对分散型醇法大豆浓缩蛋白液进行精制，制得分散型醇法大豆浓缩蛋白产品。通过以脱色率、苦味值和氨基酸损失率为考察指标进行正交试验，确定最佳脱苦脱色条件为：温度65℃、pH4、活性炭用量1.5%、时间40 min。

　　关键词：分散型醇法大豆浓缩蛋白;脱苦;脱色;脱盐

　　分散型醇法大豆浓缩蛋白是以醇法大豆浓缩蛋白为原料，经过蛋白酶在适宜条件下酶解得到分散性较高的蛋白混合物。醇法大豆浓缩蛋白生产成本低，风味和色泽良好，生产过程中对设备腐蚀小，污染环境程度小，能回收利用乙醇[1]，生产工艺符合绿色化学的要求，但是在生产过程中，由于乙醇的变性作用，使蛋白的溶解性、分散性很低(NSI<10%)，从而大大限制了其在食品中的应用。经过酶法改性的醇法大豆浓缩蛋白溶解度高、分散性好，可广泛应用于肉类食品、焙烤食品、饮料、冰淇淋等食品中[2]，不仅可以提高食品的蛋白质含量、还可以改善食品的口感及状态等。

　　酶解后的醇法大豆浓缩蛋白分散性得到明显改善，但由于酶解过程中蛋白质被水解为小分子的肽类或游离氨基酸，使疏水基团暴露出来，产生苦味[3];酶解后的蛋白液呈黄色或淡黄色，色素的存在也对应用产生限制;另外，在酶解过程中为保持pH值恒定不断加碱使酶解后的蛋白液含盐量较高，因此分散型醇法大豆浓缩蛋白存在苦味重、色泽深、含盐量高的缺点。本实验采用活性炭粉末对分散型醇法大豆浓缩蛋白进行脱苦脱色处理，利用正交试验设计确定最佳脱苦脱色条件，并利用透析袋脱盐，制得分散型醇法大豆浓缩蛋白。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　醇法大豆浓缩蛋白(蛋白质含量61.97%，NSI为9.8%)，黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司;Protamex复合蛋白酶(酶活力128000 U/g)，novo公司;苦丁茶，平邑泰奉药材进出口有限公司;活性炭粉末，东莞市得实活性炭有限公司。

　　[1]作者简介：刘成(1962—)，男，本科，主要从事农业科学研究。Email：zjl810828@163.com

　　2通讯作者：张景亮(1981—) 男，硕士，主要从事食品化学研究。

　　1.2 实验仪器

　　电子天平 梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司;pH S-25型酸度计 上海伟业仪器厂;721型分光光度计 上海光谱科学仪器有限公司;水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;HC098D34mm透析袋(3500) 上海瑞聪科技发展有限公司;旋转蒸发仪 上海格兰特理化器械有限公司;真空冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 分散型醇法大豆浓缩蛋白粗制

　　以醇法大豆浓缩蛋白为原料，采用Protamex复合蛋白酶在pH6.6，温度54 ℃，底物浓度6%，酶浓度5.5%的条件下酶解5 h，离心分离后得到分散型醇法大豆浓缩蛋白液。

　　1.3.2脱苦脱色处理

　　1.3.2.1 苦味评定

　　将1 g苦丁茶溶于1 L水中，煮沸1 h，过滤澄清后定容至1000 ml，并将其分别稀释至300 mg/L、275 mg/L、250 mg/L、225 mg/L、200 mg/L、175 mg/L、150 mg/L、125 mg/L、100 mg/L、75 mg/L、50 mg/L，其苦味值分别定义为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0[2]。

　　感官评定小组由7人组成，评定员用蒸馏水漱口后，取待评定液2 ml～3 ml置于口中，10 s后吐出，取与之味道相近的标准液品尝，如确认两味道相近，即可将待评定液的苦味值定为该标准液的苦味值，否则需取其他标准液再尝，直至确定苦味值，然后取七人评定的平均值作为苦味评定分数。

　　1.3.2.2 脱色率测定

　　将经过脱苦脱色处理的蛋白液过滤，得到上清液在波长为400 nm处测定吸光度，按下列公式计算脱色率[3]：

　　1.3.2.3 氨基酸损失率测定

　　将经过脱苦脱色处理的蛋白液过滤，得到上清液在波长为280 nm处测定其吸光度，按下列公式计算氨基酸损失率：

　　1.3.2.4脱盐率的测定

　　采用莫尔法，是以K2CrO4为指示剂，用AgNO3标准溶液进行滴定。由于AgCl沉淀的溶解度小于Ag2CrO4沉淀，因此溶液中首先析出AgCl沉淀，当溶液中的氯化物与AgNO3完全作用后，过量的AgNO3立即与K2CrO4反应生成砖红色的Ag2CrO4沉淀，指示到达终点。用已知浓度的AgNO3溶液测定其Cl-，再由Cl-按一定换算关系得到待测物的氯化钠盐含量，由此计算出含盐量，再按下式计算脱盐率：

　　1.3.2.5 活性炭粉末脱苦脱色过程

　　量取蛋白液100 ml，调节适当pH，加入一定量的活性炭粉末，在适当的温度下加热搅拌(连续搅拌以使活性炭不沉淀为宜)，达到所需时间后，趁热过滤，上清液在波长为400 nm处测定其吸光度，计算脱色率，在波长为280 nm处测定其吸光度，计算氨基酸损失率，并进行苦味评定。

　　1.3.2.6 脱苦脱色条件的优化

　　1. 时间对脱苦脱色条件的影响

　　量取蛋白液100ml，调节pH5，加入1%的活性碳粉末，60 ℃分别加热搅拌20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，测定上清液的吸光度，计算脱色率和氨基酸损失率，并进行苦味评定。

　　2. 活性炭用量对脱苦脱色条件的影响

　　量取蛋白液100ml，调pH5，分别加入0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%的活性炭粉末，60℃加热搅拌40 min。收集上清液测定其吸光度，计算脱色率和氨基酸损失率，进行苦味评定。

　　3. 温度对脱苦脱色条件的影响

　　量取蛋白液100 ml，调pH5，加入1.25%的活性炭粉末，分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃条件下加热搅拌40 min。取上清液测定吸光度，计算脱色率和氨基酸损失率，并进行苦味评定。

　　4. pH值对脱苦脱色条件的影响

　　量取蛋白液100ml，分别调pH为3、4、5、6、7，8加入1.25%的活性炭粉末，65℃加热搅拌40 min，取上清液测定其吸光度，计算脱色率和氨基酸损失率，并进行苦味评定。

　　5. 正交试验优化工艺参数

　　根据单因素试验结果，本试验采用四因素三水平的正交试验设计，以脱色率、氨基酸损失率和苦味值研究各因素对脱苦脱色效果的综合影响。正交试验设计表见表1[4]。

　　表1 正交试验设计方案

　　Tab.1 Design of orthogonal test

　　水平

　　时间(min)

　　活性炭用量(%)

　　温度(℃)

　　pH值

　　1

　　30

　　1

　　60

　　3

　　2

　　40

　　1.25

　　65

　　4

　　3

　　50

　　1.5

　　70

　　5

　　1.3.3 脱盐处理

　　将蛋白液浓缩，放入透析袋中，浸泡在去离子水中于4 ℃下透析，每2 h换一次水，透析48 h，测定蛋白液的含盐量，计算脱盐率，并在波长为280 nm处测定脱盐后蛋白液的吸光度，计算氨基酸损失率。

　　1.3.4 数据的统计分析

　　采用SAS9.0软件对分析结果进行统计、分析，采用Excel 2007软件绘制图示。

　　2 结果与讨论

　　2.1 活性炭脱苦脱色条件的确定

　　2.1.1 时间对脱苦脱色条件的影响

　　图1时间对脱苦脱色效果的影响

　　Fig.1 Effects of time for debittering and decoloration

　　从图1可以看出，随着活性炭粉末处理时间的增加，脱色率逐渐增大， 40 min后脱色效果已不明显;苦味值呈上升趋势，在20 min～40 min内明显增加，40 min后上升缓慢;随着脱色时间的延长，氨基酸损失率也越来越大，综合考虑三种指标选择适宜的时间为40 min。

　　2.1.2 活性炭用量对脱苦脱色条件的影响

　　图2 活性炭用量对脱苦脱色效果的影响

　　Fig.2 Effects of active carbon amounts for debittering and decoloration

　　活性炭用量对脱苦脱色效果有很大的影响，活性炭用量增大使溶液中的有色物质和苦味肽与活性炭接触的表面积增大，从而溶液中的苦味肽和有色物质减少的快且吸附全面[5]。由图2可以看出，随着活性炭用量的增加，脱色率不断增大，当用量达到1.25%时，趋势变得平缓;苦味值在活性炭用量0.25%～1.25%时明显增加，大于1.25%增加幅度不大;氨基酸损失率随着活性炭用量的增加而不断的增大，由此可见，综合考虑活性炭的脱苦脱色效果，1.25%为活性炭粉末的最适宜用量。

　　2.1.3 温度对脱苦脱色条件的影响

　　图3 温度对脱苦脱色效果的影响

　　Fig.3 Effects of temperature for debittering and decoloration

　　由图3可以看出，温度升高，溶液中分子运动加强，苦味肽及色素物质等大分子向活性炭表面的扩散速度增大，脱色率随着温度的升高逐渐增加，但在65 ℃后增加幅度不大;苦味值呈现不断增大的趋势;氨基酸损失率逐渐升高且在65 ℃后变化幅度很大，因此65 ℃是活性炭粉末脱苦脱色的最适宜温度。

　　2.1.4 pH对脱苦脱色条件的影响

　　图4 pH对脱苦脱色效果的影响

　　Fig.4 Effects of pH for debittering and decoloration

　　由图4可以看出，活性炭在酸性或偏酸性的溶液中脱苦脱色效果较好，当溶液的pH值接近中性时，脱色率和苦味值明显下降，而活性炭对氨基酸的吸附明显增加，氨基酸损失率随pH值的增加而不断增大，所以活性炭脱苦脱色的pH值可确定为4.0。

　　2.1.5 正交试验设计优化工艺参数

　　本实验采用综合加权评分法，脱色率、苦味值和氨基酸损失率的权重系数分别为0.4、0.4和0.2，分别把三项中最大的指标定为100分，其他各号按下式评分：

　　综合评分=(脱色率/90.24)*100*0.4+(苦味值/9)*100*0.4+(氨基酸损失率/3.82)*100*0.2

　　正交试验结果如表2所示，方差分析图见表3。

　　表2 脱苦脱色正交实验结果及分析

　　Tab.2 The result and analysis of orthogonal design for debittering and decoloration

　　试验

　　编号

　　A

　　时间(min)

　　B

　　活性炭用量(%)

　　C

　　温度

　　(℃)

　　D

　　pH

　　脱色率(%)

　　苦味值

　　氨基酸

　　损失率

　　(%)

　　综合评分

　　1

　　1(30)

　　1(1)

　　1(60)

　　1(3)

　　72.24

　　5.5

　　1.52

　　64.42

　　2

　　1

　　2(1.25)

　　2(65)

　　2(4)

　　88.52

　　7.8

　　2.96

　　89.40

　　3

　　1

　　3(1.5)

　　3(70)

　　3(5)

　　83.19

　　7

　　3.02

　　83.80

　　4

　　2(40)

　　1

　　2

　　3

　　88.43

　　6.8

　　1.5

　　77.27

　　5

　　2

　　2

　　3

　　1

　　86.33

　　7.2

　　2.76

　　84.72

　　6

　　2

　　3

　　1

　　2

　　89.82

　　9

　　3.45

　　97.88

　　7

　　3(50)

　　1

　　3

　　2

　　75.62

　　6.5

　　2.18

　　73.82

　　8

　　3

　　2

　　1

　　3

　　85.96

　　7.2

　　3.4

　　87.90

　　9

　　3

　　3

　　2

　　1

　　90.24

　　7.5

　　3.82

　　93.33

　　k1

　　79.207

　　71.837

　　83.400

　　80.823

　　k2

　　86.623

　　87.34

　　85.677

　　87.033

　　k3

　　85.017

　　91.67

　　80.78

　　82.99

　　R

　　7.416

　　19.833

　　5.887

　　6.21

　　表3 正交试验结果方差分析

　　Tab. 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

　　方差来源

　　自由度f

　　离差平方和Q

　　平均平方和 Q/f

　　F值

　　A

　　2

　　264.296600

　　132.148300

　　375.64**

　　B

　　2

　　1915.482289

　　957.741144

　　2722.46**

　　C

　　2

　　170.470489

　　85.235244

　　242.29**

　　D

　　2

　　186.601622

　　93.300811

　　265.22**

　　误差

　　18

　　6.332267

　　0.351793

　　注：F0.05(2, 2)=19.0，F0.01(2, 2)=9.0，*表示显著，**表示极显著。

　　由表2极差分析表明，各因素对活性炭粉末脱苦脱色的影响效果依次为活性炭用量>时间>pH>温度，较好的参数组合是A2B3C2D2，即温度65 ℃、pH4、活性炭用量1.5%、时间40 min。表3中方差分析表明，所有因素对综合评分均有极显著影响。

　　由于所确定的较好的参数组合未包含在上述9组实验中，因此加做一组验证试验，测得各指标的平均值分别为脱色率91.52%，苦味值9，氨基酸损失率3.02%，接近并高于正交试验中的实验结果，证明试验所得的参数组合是可靠的。

　　2.2 脱盐处理

　　脱盐处理过程中蛋白液脱盐率及氨基酸损失率如图6所示：

　　图5 分散型醇法大豆浓缩蛋白脱盐处理曲线

　　Fig.5 Plot of desalting for dispersed alcohol leaching soy protein concentrate

　　由图5可以看出，随着时间的延长，脱盐率逐渐增大，到48 h时脱盐率达到86.68%，氨基酸损失率随时间的延长不断增加，但增加幅度较小，到48h时，氨基酸损失率仅达到0.57%。由此可见，用透析袋进行脱盐处理的效果较好，脱盐率高，氨基酸损失率低，但是仍存在处理时间长，处理量少等不足，所以只适合实验室内操作。

　　经过脱苦脱色、脱盐处理的分散型醇法大豆浓缩蛋白液通过旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥制得分散型醇法大豆浓缩蛋白，产品色泽呈乳白色，苦味基本脱除。

　　3 结论

　　利用活性炭粉末对分散型醇法大豆浓缩蛋白脱苦脱色，操作简单有效，经济实用，既能脱除苦味肽、又能吸附色素等有色物质，是工业化大生产中较为适用的一种方法。综合考察脱色率、苦味值及氨基酸损失率各项指标，确定脱苦脱色的最佳条件为：温度65 ℃、pH4、活性炭用量1.5%、时间40 min。利用透析袋进行脱盐处理48 h，脱盐率高，氨基酸损失率较低，效果较好。

　　参考文献

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