摘要: 为了研究基因疫苗对绵羊的免疫保护效果，构建了捻转血矛线虫Hc38基因DNA疫苗。将捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，经酶切、PCR和序列测定等方法鉴定重组载体正确，并免疫鼠8天后用RT-PCR检测到该疫苗在鼠肌肉组织中进行了转录。将纯化的DNA 疫苗肌注绵羊后，用Western blotting和ELISA方法检测疫苗在绵羊体内的翻译和诱导IgG 的产生。2免后2周用10000条捻转血矛线虫第3期幼虫攻击实验动物，检测绵羊粪便虫卵排出、成虫数量等免疫保护性指标。该捻转血矛线虫Hc38DNA 疫苗与对照组比较，免疫组绵羊排出虫卵减少66.6%、成虫减少33.1%。特别值得注意的是免疫组的静脉注射方式产生抗体最高，相应羊的虫卵数和成虫数低。本实验证明Hc38基因DNA疫苗对绵羊虫卵及成虫发育具有明显的抑制作用。
关键词：绵羊；捻转血矛线虫；Hc38；pcDNA3.1；DNA 疫苗
 Protective Effects Of Hc38 DNA Vaccines for Haemonchus contortus in Sheep
Abstract: The study was carried out to construct DNA vaccines for Haemonchus contortus, and test its protective effects in sheep. Hc38 gene putative protain conserved domain of Haemonchus Contortus was inserted into pcDNA3.1. The recombinants were identified by double enzyme digestion,PCR and sequencing. The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-Hc38 was successfully constructed. Transcriptions of the vaccines in mouse muscles were confirmed in eight days by RT-PCR. Lambs were immunized with DNA vaccines about 28 and 14 days before challenged by 10000 H. contortus L3. The expression of vaccines in sheep was analyzed by Western blotting. While the IgG stimulated with the vaccines was checked by ELISA. After  challenge with L3, EPG (eggs per gram feces), L3 hatched from eggs and worm burdens of lambs were counted. And the serum anti-Hc38 antibodies were inspected by ELISA about ten days after the first immunization. After challenged with L3, it was found that EPG and worm burdens of lambs, immunized with Hc38 DNA vaccines reduced by 66.6%and 33.1%, percentage of L3 hatched from eggs was very low respectively, compared with the sheep administered with control and special antibody was highest by intravenous injection.  The results showed that the recombinant plasmids carrying Hc38 gene could inhibite from the egg and growth of H. contortus effectively.
Key words: Sheep；Haemonchus contortus；Hc38； pcDNA3.1；DNA vaccine
   捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是寄生于牛、羊等反刍动物皱胃的一种重要消化道寄生虫，成虫的嗜血性引起动物贫血及贫血综合征，羔羊感染后死亡率达30%以上^[1]。虽然
 

收稿日期：2009-02-16
基金项目：新疆兵团科技局社会发展项目（2006GG31）
作者简介：郑金海（1977-），男，内蒙古锡林浩特人，硕士研究生，主要从事动物寄生虫生物学研究，E-mail：zjhai2006@yahoo.com.cn，电话：0993-6683156；*为通讯作者，E-mail：boxinwen@yahoo.com.cn。
药物治疗取得了较好的效果，但存在严重的药物残留和环境污染问题^[2]。抗药性虫株的出现和蔓延，使得传统的化学治疗受到了严重挑战，给畜牧业生产带来了极大的经济损失^[3]，免疫学方法控制该病将是一种高效环保的防治手段。
Hc38基因是Hartman等（2001年)在研究该线虫的发育调节基因时用Northern杂交得到的，根据该基因在线虫肠上皮微绒毛内呈高丰度表达，推测该基因产物可能与吸血或者免疫逃避机制有关^[4]。薄新文等^[5]（2004年）使用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术首次克隆到Hc38基因的全长cDNA，并用免疫印迹（Western blotting）证明了该基因的读码框ORF（open reading frame）的位置和大小、信号肽的长度、分泌特性以及水解酶裂解位点等，它的196-512位氨基酸残基构成了一个保守结构域，该结构域属于功能未知的pf04910蛋白家族，该蛋白家族目前有14种生物为人类或动物的重大血源性疫病病原或媒介。荣光等^[6](2006年)通过RNA干扰试验发现，干扰组幼虫的绵羊体内捻转血矛线虫虫卵、虫卵孵化率、雌虫数、雄虫数、成虫数较对照组明显减少。赵军民等^[7](2007年)将Hc38基因保守结构域抗原免疫绵羊后，免疫组和对照组在虫卵孵化率、成虫计数等方面差异显著，尤其是雄虫数明显减少，进一步证实该基因与吸血或免疫逃避有关。
核酸疫苗是一种新型疫苗，以MHCⅡ和MHCⅠ途径进行抗原递呈，不但引起体液免疫应答反应，而且可引起机体细胞免疫应答反应，易保存、制备简单等优点使其成为寄生虫疫苗研究的热点之一^[8]，Schistosoma japonicum^[9]，Leishmania donovani^[10]和Plasmodium falciparum^[11]等，Charles等^[12]在寄生虫研究中取得了重要进展。本文在捻转血矛线虫Hc38基因研究的基础上，通过真核表达对其免疫保护作用进行研究。以期望阐明Hc38基因的功能，搞清pf04910蛋白家族基因的功能提供依据，为防治14种人类或动物的重大血源性疫病病原或媒介，同时为捻转血矛线虫的疫苗研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌种  pcDNA3.1（+）质粒购自Invitrogen公司，pMD19T-Hc38、pPROEXHTa-Hc38、E.coli DH_5α由本实验室保存。
1.2 试剂与实验动物  DNA 分子量标准物为MBI公司产品；T₄ DNA 连接酶、限制性内切酶和无DNA 酶RNA 酶为大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司产品；反转录酶M-MLV为Promega公司产品；Trizol试剂为Invitrogen产品；Taq^TM 酶、dNTP、DL2000 DNA maker均购自天根生化科技公司；兔抗羊IgG-HRP为北京博奥森公司产品；重组Hc38蛋白由本实验实制备；卵磷脂购自上海生物工程公司；GenEscort购自南京慧基生物技术有限公司；小鼠4只，购自石河子大学实验动物中心。
1.3 疫苗载体构建与鉴定  设计引物将Hc38基因保守结构域从pMD19T-Hc38上扩增出来，分别将pcDNA3.1、Hc38片段用HindⅢ、XbaⅠ双酶切，回收目的基因片段和载体片段，4℃连接过夜；将连接产物转化E.coli DH_5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性的平板，37℃温箱中培养16～20 h；挑单个菌落，37℃摇菌过夜；提取质粒，分别质粒PCR鉴定和HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定，筛选阳性克隆测序；序列测定由上海生工代理。引物如下所示。
P1：5'- CCCAAGCTTCACCATGGGGAAAG -3'；
P2：5'- TGCTCTAGAGGTGCCTTAATCTGGT -3。
1.4  DNA疫苗的制备与纯化  大量培养pcDNA3.1-Hc38重组菌，收集细菌沉淀，按照分子克隆（第三版）^[13]碱裂解法大量提取和PEG法纯化质粒。
1.5 RT-PCR检测DNA疫苗的转录  肌肉多点注射小鼠8d后，取疫苗注射部位肌肉提取RNA，溶于20μl DEPC水。为防止质粒DNA污染，反转录前用无RNase的DNase处理肌肉RNA，然后进行RT-PCR。用于扩增捻转血矛线虫Hc38基因的引物同上。
1.6 绵羊免疫保护性试验
1.6.1 动物分组 选择体重相当、驱虫后检测无捻转血矛线虫、5～7月龄健康绵羊10只，随机分成2组；对照组为1号和2号，实验组为第3～10号；首免和二免间隔2 w。第2次免疫后14d，每只绵羊感染10000只捻转血矛线虫第三期幼虫（L3）。免疫途径、方式和剂量如表1所示；脂质体佐剂的制备方法参考文献^[14]。
表1 实验动物分组及免疫情况
Table 1  Detailed information about every group and immunization

No	首免途径及剂量 First immunization	二次免疫途径及剂量 Boosting
1	无	无
2	肌肉多点注射pcDNA3.1质粒600ug	肌肉多点注射pcDNA3.1质粒600ug
3	肌肉多点注射重组质粒600ug	无
4	肌肉多点注射重组质粒600ug	肌肉多点注射重组质粒600ug
5	静脉注射重组质粒600ug	静脉注射重组质粒600ug
6	涎腺注射重组质粒600ug	涎腺注射重组质粒600ug
7	多途径（肌肉、静脉、皮下）注射重组质粒600ug	多途径（肌肉、静脉、皮下）注射重组质粒600ug
8	肌肉多点注射重组质粒1500ug	肌肉多点注射重组质粒1500ug
9	脂质体重组质粒肌肉多点注射600ug	脂质体重组质粒肌肉多点注射600ug
10	肌肉多点注射GenEscort150ul+重组质粒600ug	肌肉多点注射重组质粒600ug

1.6.2 Western Blotting检测DNA疫苗的翻译  以pPROEXHTa-Hc38原核表达蛋白制样、SDS-PAGE、电转移至硝酸纤维膜后，以核酸疫苗第2次免疫后2w绵羊血清为一抗、兔抗羊IgG-HRP为标记二抗进行免疫印迹。
1.6.3 ELISA检测抗体水平 于第1次免疫后9 d、第2次免疫后4、10、18、24、52d采血分离血清，l﹕50 稀释后按常规方法操作^[15]。
1.6.4 虫卵计数 采用麦克马斯特氏法^[16]。捻转血矛线虫L3感染后，分别于第21、23、25、27、29、31、33 天羊直肠采集粪便，用于虫卵计数。
1.6.5 成虫计数 感染L3后第33 d，颈动脉放血致死绵羊，收集第四胃，分离捻转血矛线虫，分别计数雌雄虫数目。
2  结  果
2.1  DNA 疫苗的构建及鉴定
2.1.1 通过质粒PCR扩增，电泳得到约450bp的扩增产物，与预期结果相符（图1）。

M.DL2000 DNA 分子量标准；  1.阴性对照 ； 2.Hc38保守结构域所在基因片段扩增产物
M.DL2000 DNA  ladder marker ；  1..negative control ； 2.PCR products of Hc38gen of conserved domain in fragment
图1  Hc38保守结构域所在基因片段PCR产物电泳结果
Fig.1 Agarose gel electrophoresis PCR products of Hc38 gene of conserved domain in fragment
2.1.2  重组质粒双酶切鉴定，电泳得到约为442bp和5348bp的条带(图2)，与预期结果相符。                                                                                                                                                                

  M. 100bpDNA 分子量标准 ；     1/2. 重组质粒pcDNA-Hc38经Hind Ⅲ 和 Xba I 双酶切后的产物
M. 100bpDNA ladder marker ；  1/2. Recombinant Plasmid  digested with Hind Ш and XbaⅠof pcDNA3.1-Hc38
图2  重组质粒pcDNA3.1-Hc38的双酶切电泳结果
Fig.2  Double enzyme digestion of Recombinant Plasmid pcDNA-Hc38
2.2  DNA疫苗的制备与纯化  多次大量提取质粒并纯化后，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀的值均在1.8～2.0范围内，达到了疫苗注射的要求，并肌肉多点注射小鼠200ug后未见明显不良反应。
2.3  RT-PCR检测  重组质粒免疫后8d，在小鼠注射部位的肌肉中检测到Hc38基因的转录，而对照组无相应的扩增（图3、图4）。
                
M．RNA分子量标准；      1、2  分别为重组质粒免疫注射部位肌肉提取的总RNA
M．The RiboRuler™ High Range RNA Ladder；     1 、2  Total  RNA  of  muscle of  injection  sites  respectively   
图3 总RNA提取电泳结果
Fig.3  Total  RNA
 

M. 100bpDNA 分子量标准 ；   1、3 分别为 pcDNA3.1 免疫组注射部位肌肉；2、4分别为pcDNA3.1-Hc38免疫组注射部位肌肉
M. 100bpDNA ladder marker ； 1、3   negative controls ；  2、4  muscle of pcDNA 3.1-Hc38 of  injection  sites  respectively
图 4  RT-PCR 检测DNA 疫苗的转录
Fig. 4 Detection the transcriptions of DNA vaccine by RT-PCR
2.4  Western blotting检测  重组质粒第2次免疫后8d，采羊血清检测重组Hc38抗原，在约17KD处出现明显的印迹条带（图5）,大小与Hc38保守区的理论值一致。

M．蛋白质分子量标准；1.pPROEXHTa表达产物；2.pPROEXHTa-Hc38诱导表达包涵体的纯化产物；3.羊血清与Hc38蛋白免疫印迹
M. protein molecular mass marker；    1.SDS-PAGE of expression product inclusion from pPROEXHTa；      2.SDS-PAGE of purfied expression product from pPROEXHTa-Hc38；     3.Western blotting was probed to Hc38 expression purfied product with sheep serum
图5  Western Blotting 检测DNA疫苗的表达
Fig. 5  Detection the expression of DNA vaccines by Western Blotting
2.5  ELISA检测血清抗体  第1次免疫后9d抗体滴度达到较高水平，然后急剧下降；在第2次免疫后4d，抗体开始迅速升高，第2次免疫后10d，达到较高点，然后发现抗体滴度下降到较低水平后开始回升，并维持在一个较高水平。同时发现5号羊抗体水平最高，9号羊抗体变化幅度最大，4号和7号抗体也能维持在较高水平。以下是疫苗免疫后，抗体消长曲线（图6、图7）。

图6  抗体变化规律
Fig.6  Dynamics of sheep anti-Hc38 antibody

图7  免疫组总体抗体变化规律
Fig.7  Dynamics of  sheep anti-Hc38 antibody in overall immunity group
2.6  虫卵计数  攻虫后第21天，粪便中开始能检测到少量的捻转血矛线虫虫卵，随着时间推移，对照组和核酸疫苗免疫组每克粪便虫卵数（EPG）逐渐增加（如图8、图9）。
 
图8  虫卵排出数变化规律
Fig.8   Dynamics of eggs shedding

图9  免疫组总体虫卵排出数变化规律
Fig.9  Dynamics of eggs shedding in overall immunity group
2.7 成虫减少率  感染捻转血矛线虫L3后33d，剖检羊第四胃，收集成虫，按雌雄虫分别计数。对照组平均每只羊的雌虫、雄虫、成虫荷虫数分别为500、450、950，而核酸疫苗免疫组分别为345.3、290.6、635.9（表2）。免疫组与对照组相比，雌虫减少31%、雄虫减少36%、成虫减少33.1%。
表 2 羊胃内捻转血矛线虫成虫计数
Table 2   Abomasal worm burdens

分组 Group	雌虫 Female worms	雄虫 Male worms	总数 Total worms	雌雄比 Female/male	成虫减少率（%） Reduction in worm burdens
对照组 Control	500±87.5	450±50	950±137.5	1.11	——
实验组 Experimental	345.3±60.3	290.6±56.3	635.9±104.9	1.19	33.1

3 讨 论
本文通过绵羊免疫保护性试验发现，捻转血矛线虫Hc38保守结构域DNA疫苗具有一定的保护作用，该DNA疫苗使绵羊虫卵排出数、成虫荷虫量分别减少了66.6%、33.1%，虫卵孵化率低于5%。核酸疫苗表达的抗原蛋白在动物体内能够得到较好的表达，从而诱导产生较全面的免疫应答反应。在抗捻转血矛线虫免疫中，Th2型T细胞处于重要的地位^[17]，但与寄生部位局部黏膜的T、B 细胞免疫应答、特异性IgA、IgE、IgG1 等抗体的产生、嗜酸性粒细胞和肥大细胞的浸润也密切相关，这些免疫细胞和免疫因子在“快速排斥反应”和“迟发性排斥反应”中变化尤其明显^[18,19]。研究表明，DNA 疫苗不仅能引起体液免疫应答，而且可以诱导机体产生细胞免疫应答，尤其可诱导在抗线虫免疫中发挥重要作用的CTL应答反应。本研究发现，该基因DNA疫苗第2次免疫后，5号羊静脉注射方式产生的抗体较高，虫卵数和成虫数也较低；同时8号羊抗体不是最高，虫卵数也较低，这说明在抗捻转血矛线虫免疫中，不仅仅是抗体发挥保护作用，这可能是DNA疫苗免疫效果优于重组蛋白的另外一个原因。已有的研究表明，将IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN-γ、GM-CSF等作为基因佐剂用于DNA免疫，极大的增强了核酸疫苗的免疫原性，抗体水平、CTL、DTH等显著提高，提高了免疫效果^[20~22]。将重组细胞因子与该DNA疫苗联合应用或将细胞因子基因与Hc38基因融合表达构建免疫调节型DNA疫苗，或将捻转血矛线虫Hc38抗原与其它抗原联合使用，制成多价基因疫苗也可能是提高免疫保护的另外一种策略。同时，实验发现8号注射较大剂量疫苗对虫卵数有较好的抑制作用；9号注射脂质体佐剂的绵羊成虫数最少。本实验证明肌肉注射和联合注射免疫途径能产生较高的抗体水平，和Fynan等^[23]不同免疫途径的保护效果相符。因此，进一步优化免疫途径、免疫剂量和免疫途径将有利于提高疫苗的免疫保护效果。
本研究通过Hc38基因保守结构域的绵羊免疫保护性试验，证实了捻转血矛线虫Hc38 DNA疫苗具有一定免疫保护作用，这为研发新型捻转血矛线虫疫苗提供了新思路，为解决目前尚无有效疫苗现状提供了可能。迄今为止，DNA疫苗的免疫保护效果有待进一步提高，其免疫保护作用机理有待深入探讨。
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