摘要：通过响应面分析法优化了乳酸菌和酵母菌联合在苹果渣中液态发酵培养的条件，确定最佳培养条件为：料水比1:10、发酵温度37℃、菌种比例1:1:1:4、培养时间4d，在此条件下活菌数可达2.39×108个/ml。说明利用响应面分析法得到的培养条件参数是真实的，具有实用价值，为进一步的研究提供实验依据。

　　关键词：苹果渣 乳酸菌 酵母菌 液态发酵 菌剂

　　本研究从我国苹果产业和农业生产实际出发，依据社会需求和自身研究条件，针对果渣蛋白质含量低(干基中约5%)、营养价值低、直接饲喂的效果不好的现状[3]，拟将鲜果渣和益生菌结合，采用现代生物发酵技术，以鲜果渣为基质，用有益微生物发酵果渣，提高果渣的蛋白质、氨基酸、肽、维生素、酶类、核苷、有机酸等生物活性物质的含量，同时培养出高浓度的益生菌菌体，以期获得具有发酵菌剂和微生态制剂双重功能的产品。 一

　　方面可为木屑找到合适的替代物和缓解环境压力;另一方面，益生菌发酵可消除或减少果渣中的抗营养因子(如单宁、果胶等)，提高酸性和中性洗涤纤维的消化率，同时产品中浓集益生菌菌体可被禽畜直接采食。此法条件温和，提高蛋白质含量，避免了二次排渣，从而减少果渣利用时的二次环境污染，且工艺及设备简便，成本低，易规模化推广应用，适宜于农业/畜业生产使用。不仅解决了长期困扰果汁加工企业的环境问题，而且为畜牧业的发展提供了新型菌剂和蛋白资，为实现苹果渣的全面彻底利用提供科学依据[4-5]。

　　1试验菌种、材料和仪器

　　1.1试验菌种

　　保加利亚乳杆菌(Lactobacillus.Bulgaricus，L.B.)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus，S.T.)、嗜酸乳杆菌(LactobacillusAcidphilus，L.A.)和酵母1867均由陕西科技大学生命科学与工程学院微生物教研室提供.

　　1.2材料

　　过60目筛苹果渣由陕西天佑果蔬制品有限责任公司提供;

　　营养素1：自制

　　营养素2：自制

　　乳酸菌培养基：MRS;酵母菌培养基：YPD培养基

　　发酵培养基： 苹果渣 营养素1 2% 营养素2 2.5% 121℃灭菌30min

　　1.3仪器

　　显微镜 重庆光学仪器厂;显微摄影系统 SAMRT系列生物显微镜;超净工作台 苏净集团安泰公司;PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械 ; LS-C50L型立式压力蒸汽灭菌锅 江阴滨江医疗设备厂;CS101-2A电热鼓风干燥箱 重庆银河试验仪器有限公司;BS210S电子天平 北京赛多利斯天平有限公司;CS10—2A电热鼓风干燥箱 重庆银河试验仪器有限公司;微量进样器 上海医用激光仪器厂;PB-10 酸度计 北京赛多利斯天平有限公司。

　　1.4检测内容

　　(1)pH值：用酸度计PB一10直接测定;

　　(2)菌体形态：取发酵液经甲苯胺蓝染色后镜检[6];

　　(3)活菌数：显微镜下直接计数[7]和稀释平板培养计菌落数两种方法[8]。

　　2 试验方法

　　2.1单因素试验

　　按发酵培养基配方配制培养，灭菌后无菌操作，以6%接种量接入发酵菌种，分别以发酵温度、菌种接种比例、料水比和发酵周期为单因素进行试验，测定活菌总数。

　　2.2 Box-Benhnken试验[9-10]

　　根据Box-Benhnken实验设计原理,综合单因素试验结果,选取对发酵液活菌总数影响显著的3个因素发酵温度、菌种接种比例和发酵时间,采用3因素3水平的响应面分析方法,设计中心组合实验。

　　3 结果与分析[11-16]

　　3.1发酵条件单因素试验

　　3.1.1发酵温度对活菌数的影响

　　准确称取1.00g过筛苹果渣，添加要求量的营养素1和营养素2，再按料水比1:10，接种量6%,其中LA：LB：ST：Y=1:1:1:3，分别在33℃、35℃、37℃、39℃、41℃培养，每天测定其pH值变化和活菌数，结果如下：

　　图1 不同温度下培养活菌数变化趋势图

　　由图1可知，温度对菌体生长状况的影响比较明显，但整体趋势一致。在整个培养过程中，第1天到第2天菌体生长旺盛，第3天时活菌变化趋于平缓，第4天内活菌数无明显增加;33℃下菌体生长最慢;41℃、393天后，活菌数相差不大，都在108个/ml以℃、37℃和35℃生长状况无明显差异;培养上，但镜检观察41℃、39℃时乳酸菌占绝对优势，酵母菌极少，而37℃和35℃乳酸菌和酵母菌分布相对比较好且菌体生长时间短，综合考虑取37℃为宜。

　　Fig.1　Effect of different temperture on the sum of living bacteria

　　3.1.2不同接种比例对活菌数的影响

　　准确称取1.00g过筛苹果渣，添加要求量的营养素1和营养素2，再按料水比1:10， 37℃培养，接种总量6%,接种比例分别为1:1:1:1、1:1:1:2、1:1:1:3、1:1:1:4、1:1:1:5和1:1:1:6。每天测定其pH值变化和活菌数，结果如下：

　　结合上述图2可以看出，不同接种比例在发酵前期几乎没有差异，但一天后开始有微略差别，到第3天和第四天差别比较明显;接种比例在1:1:1:1到1:1:1:3时无明显差别，但1:1:1:3后与前者比较相差较大，但相近比例间区别不大，活菌数都在108个/ml以上，最高可达2.45×108。

　　图2 不同接种比例活菌变化趋势图

　　Fig.2 Effect of inoculum ratio 0n the sum of living bacteria

　　3.1.3不同料水比对活菌数的影响

　　准确称取1.00g过筛苹果渣，添加要求量的营养素1和营养素2，接种总量6%,接种比例分别为1:1:1:4，分别在料水比6:1、8:1、10:1、和12:1下37℃培养，每天测定其pH值变化和活菌数，结果如下：

　　由图3可以看出，不同料水比对最终活菌数几乎不影响，同时也说明只要复合一定量其他营养物质，不仅液态发酵有可能取得较好的效果，固态发酵也大有可能实现。本实验从最终产品需要出发才用1:10为宜。

　　图3 不同料水比活菌数变化趋势图

　　Fig.3 Effect of ratio of liquid to solid on the sum of living bacteria

　　3.1.4不同料水比对活菌数的影响

　　准确称取1.00g过筛苹果渣，添加要求量的营养素1和营养素2，料水比1:10,接种总量6%,接种比例分别为1:1:1:4，37℃培养，观察不同培养周期活菌数的变化情况，结果如下：

　　由图4可以看见，不同发酵周期对活菌数有一定的影响，尤其是前三天之间的变化比较明显，第四天与第三趋于平稳，这也符合微生物生长曲线，第五天和第六天略有下降，可能是发酵后期部分酵母菌自溶导致。

　　图4不同发酵周期活菌数变化趋势图

　　Fig.4　 Effect of fermentation time on the sum of living bacteria

　　3.2响应面分析法优化培养工艺条件

　　3.2.1　Box-Benhnken实验结果(表1)

　　实验1～12为析因实验,13～15为中心实验。其中：中:X1=(培养温度 -37)/2,X2=(料水比-4)/2,X3=(培养时间-96)/12。各因素的水平根据单因素实验选择,以能够反映整个因素变化过程为准,以得到较好的回归方程。如果某因素对结果的影响很大,可以扩大水平的范围以期得到好的回归模型,如果选择的水平范围太窄,则不足以反映该因素的变化过程[6,7]。

　　表1 Box-Benhnken设计方案及实验结果

　　Tab.1 Box-Benhnken design matrix and results of tests

　　实验编 号

　　编码值

　　实际值

　　培养结束活菌数(108个/ml)

　　A

　　B

　　C

　　培养温度(℃)

　　菌种比例

　　培养时间(h)

　　1

　　-1

　　-1

　　0

　　35

　　1:1:1:2

　　96

　　1.76

　　2

　　-1

　　1

　　0

　　35

　　1:1:1:6

　　96

　　2.15

　　3

　　1

　　-1

　　0

　　39

　　1:1:1:2

　　96

　　1.45

　　4

　　1

　　1

　　0

　　39

　　1:1:1:6

　　96

　　1.91

　　5

　　0

　　-1

　　-1

　　37

　　1:1:1:2

　　84

　　1.65

　　6

　　0

　　-1

　　1

　　37

　　1:1:1:2

　　108

　　2.32

　　7

　　0

　　1

　　-1

　　37

　　1:1:1:6

　　84

　　2.36

　　8

　　0

　　1

　　1

　　37

　　1:1:1:6

　　108

　　2.48

　　9

　　-1

　　0

　　-1

　　35

　　1:1:1:4

　　84

　　1.94

　　10

　　1

　　0

　　-1

　　39

　　1:1:1:4

　　84

　　1.47

　　11

　　-1

　　0

　　1

　　35

　　1:1:1:4

　　108

　　1.84

　　12

　　1

　　0

　　1

　　39

　　1:1:1:4

　　108

　　1.75

　　13

　　0

　　0

　　0

　　37

　　1:1:1:4

　　96

　　2.42

　　14

　　0

　　0

　　0

　　37

　　1:1:1:4

　　96

　　2.39

　　15

　　0

　　0

　　0

　　37

　　1:1:1:4

　　96

　　2.40

　　3.2.2响应面分析方案及结果

　　对表1中活菌数Y及3个因素A、B、C的数值,利用Design Expert 7·0软件进行回归分析,得到以下回归方程:

　　Y=2.40333-0.13875A+0.21500B+0.1215C+0.017500AB+0.09500AC-0.13750BC-0.51917A2-0.066667B2-0.13417C2

　　回归方程的方差分析见表2。

　　表2回归方程的方差分析

　　Tab.2 Variance analysis of items of regression equation

　　来源

　　自由度

　　平方和

　　均方

　　F

　　Prob﹥F

　　回归模型

　　9

　　1.78

　　0.20

　　21.07

　　0.0018

　　A

　　1

　　0.15

　　0.15

　　16.37

　　0.0099

　　B

　　1

　　0.37

　　0.37

　　39.31

　　0.0015

　　C

　　1

　　0.12

　　0.12

　　12.50

　　0.0166

　　AB

　　1

　　1.225E-003

　　1.225E-003

　　0.13

　　0.7330

　　AC

　　1

　　0.036

　　0.036

　　3.84

　　0.1074

　　BC

　　1

　　0.076

　　0.076

　　8.04

　　0.0365

　　A2

　　1

　　1.00

　　1.00

　　105.78

　　0.0001

　　B2

　　1

　　0.016

　　0.016

　　1.74

　　0.2438

　　C2

　　1

　　0.066

　　0.066

　　7.06

　　0.0450

　　残差

　　5

　　0.047

　　9.408E-003

　　失拟项t

　　3

　　0.047

　　0.016

　　76.54

　　净误差

　　2

　　4.667E-004

　　2.333E-004

　　总误差

　　14

　　1.83

　　R=0.9871

　　由F检验,当Prob>F值小于0.05即可认为该指标显著,当小于0.01时即为高度显著(Prob>F即为F检验的P值)。从表2可以看出,整体模型的“Prob>F”值小于0.01表明该二次方程模型高度显著;R=0.9871,表明回归方程能够很好地模拟真实的曲面。从回归方程各项方差的进一

　　步检验可看出:A2和C2为显著性影响因素,而且方程的失拟项很小,表明该方程对实验拟合情况好、误差小,因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。为了更直观地反映各因素间的相互作用对提取率的影响,采用MINITAB软件,做出特定的响应面Y对应的因素A、B、C构成的三维空间,可以直观反映各因素交互作用对响应值的影响,结果如图5~图7所示。比较图5~图7可知:发酵温度与培养时间的影响显著,表现为曲线较陡;而菌种比例次之,表现为曲线较为平滑,且随其数值的增加或减少,响应值变化较小。

　　图5 培养时间与发酵温度对活菌数的响应面及等高线图

　　Fig.5　Surface plot and contour plot of effects of fermentation time and different temperture on the sum of living bacteria

　　图6 发酵温度与接种比例对活菌数的响应面及等高线图

　　Fig.6　Surface plot and contour plot of effects of different temperture and noculum ratio on the sum of living bacteria

　　图7 培养时间与菌种比例对活菌数的响应面及等高线图

　　Fig.7　Surface plot and contour plot of effects of fermentation time and noculum ratio on the sum of living bacteria

　　由该系统optimization软件确定出最佳培养条件为：料水比1:10、发酵温度37℃、菌种比例1:1:1:4、培养时间4d.为了更好的符合实际操作，在上述工艺条件下经过回归方程计算活菌数达2.4×108个/ml.

　　就上述选取的工艺条件进行验证实验,结果如表3所示。

　　表3最佳条件下的实验值(n=3)及方程值

　　Tab.3 The experimental(n=3)and equational

　　values of the optimum extraction conditions

　　最佳条件

　　活菌数

　　(108个/ml)

　　实验值

　　发酵温度37℃

　　菌种比例1:1:1:4

　　培养时间4d

　　2.387

　　方程预测

　　发酵温度37℃

　　菌种比例1:1:1:4

　　培养时间4d

　　2.403

　　从表3可以看出，实验值与理论值比较接近，这说明利用响应面分析法得到的培养条件参数是真实的，具有实用价值。

　　3.3菌体形态图

　　图a、图b和图c从左到右分别是35℃、37℃和39℃在接种比例1:1:1:2、1:1:1:4和1:1:1:6发酵终期时菌体形态图。由图可见：随温度的升高，酵母菌数量降低，乳酸菌数目增多，尤其是39℃时嗜热链球菌增长明显;综合考虑，37℃时四种菌分布相对比较均匀，总菌数也较好。

　　图a -1

　　图a-3

　　图a-2

　　图b-1

　　图c-1

　　图c-2

　　图c-3

　　图b-3

　　图b-2

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