摘要：以3-甲醛基-苯并噁嗪-2-酮和罗丹明B酰肼为原料，经缩合反应合成一种新型比色探针RC，并利用1HNMR、13CNMR和MS对其进行结构表征。利用紫外-可见紫外光谱法研究了探针RC在乙醇溶液中的金属离子识别性能。该探针在λ= 496 nm处对Cu2+和Cd2+发生不同程度的红移，裸眼可观察到明显的颜色变化，而且不受其它离子的干扰;通过Job-plot曲线和Benesi-Hildebrand方程计算出探针RC与Cu2+和Cd2+的结合比均为1:1，结合常数K分别为6.44×105和1.17×105，并测得Cu2+和Cd2+的最低检测限分别为5.80×10-6M和9.19×10-6M。

　　关键词:比色探针;罗丹明;光谱性能;Cu2+和Cd2+

　　中国分类号： O657.3 文章标识码：A

　　金属离子在生命活动中扮演着重要的角色，然而金属离子所引起的生物体的蓄积毒性和环境污染问题也愈来愈受到人们的广泛关注。其中，铜(Cu2+)和铬(Cd2+)被认为是一种重要的金属污染源。Cu2+参与生物体中的催化氧化、氧化还原等重要生理功能，而且Cu2+还与阿尔茨海默病、肝硬化、朊病毒病密切相关[1-3];Cd2+对环境和人体健康均可造成严重危害，特别对人体肾脏、肝脏、骨骼和神经系统构成严重威胁，可导致肾功能紊乱、钙功能失调，甚至致癌[4, 5]。因此，设计开发能够检测痕量金属离子的有效方法具有重要意义。

　　近年来，基于罗丹明母核结构进行检测探针的研究日益活跃，已广泛应用于生物成像、疾病诊断、环境检测和分析化学等领域[6-8]。本文基于罗丹明母核和苯并噁嗪-2-酮的多位点络合金属离子的独特性质，通过亚胺结构缀合3-甲醛基-苯并噁嗪-2-酮和罗丹明B酰肼，合成了一种能同时检测Cu2+和Cd2+的金属离子比色探针。探针RC的合成路线如下图所示。

　　1实验部分

　　1.1主要仪器与试剂

　　AVANCE III HD-400 型核磁共振仪(瑞士布鲁克-拜厄斯宾有限公司);Ultraflextreme MALDI-TOF质谱仪(美国布鲁克-道尔顿公司);莱伯泰科UV-9100紫外可见分光光度计(北京瑞尔欣德科技有限公司);微量进样器(上海高鸽工贸有限公司)，柱色谱用硅胶(200-300目，青岛海洋化工厂)。

　　间二乙胺基苯酚、亚硝酸钠、二氧化硒、保险粉、水合肼、罗丹明B、1,4-二氧六环(AR，国药集团化学试剂有限公司);光谱测定用溶剂为色谱级市售工业品(阿拉丁试剂有限公司);化合物2参照文献[9]合成。化合物4参照文献[10]合成。离子溶液按照标准方法配制。

　　1.2 化合物5的合成

　　罗丹明B(479.0mg，1.0 mmol)溶解于15mL乙醇中，将水合肼0.36mL缓慢加入上述溶液中，回流反应3小时，待反应溶液颜色由深紫色变成橘黄色直至无色，TLC板跟踪反应完成。然后减压蒸除溶剂，剩余物溶于二氯甲烷，水洗，干燥，蒸除溶剂得到粉红色固体产物，Al2O3柱层析(V(石油醚):V(乙酸乙酯) =3:1)得白色固体5(367.0 mg，产率81%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.94 (dd, J = 5.8, 2.8 Hz, 1H), 7.48 – 7.41 (m, 1H), 7.10 (dd, J = 5.8, 2.7 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 3.61 (s, 1H), 3.34 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.16 (t, J = 7.0 Hz, 6H). HRMS (ESI): calcdfor[M+H]+(C28H32N4O2) requires m/z457.2606, found 457.2606.

　　1.3目标化合物RC的合成

　　化合物5 (492.0 mg, 2.0 mmol) 和化合物4(913.0 mg, 2.0 mmol) 置于50 mL圆底烧瓶中，加入15 mL无水乙醇和1滴乙酸，回流反应12 小时，冷却至室温，有大量沉淀析出。过滤，固体用少量乙醇润洗，然后用乙醇重结晶得到橙黄色固体RC (1.12 g，产率82%)。1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 8.09-8.02 (m, 2H); 7.62 (d, J= 9.2 Hz, 1H); 7.51-7.42 (m, 2H); 7.07 (d, J= 7.3 Hz, 1H); 6.59 (dd, J= 9.2, 2.6 Hz, 1H); 6.53 (d, J= 8.8 Hz, 2H); 6.48 (d, J= 2.4 Hz, 2H); 6.29 (d, J= 2.5 Hz, 1H); 6.23 (dd, J= 8.9, 2.5 Hz, 2H); 3.39 (q, J= 7.1 Hz, 4H); 3.31 (q, J= 7.0 Hz, 8H); 1.19 (t, J= 7.1 Hz, 6H); 1.14 (t, J= 7.0 Hz, 12H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ: 165.6, 153.8, 153.3, 152.8, 150.8, 149.7, 149.3, 138.0, 136.9, 134.1, 131.8, 128.3, 128.0, 127.4, 123.9, 123.8, 123.6, 110.1, 108.3, 104.6, 98.3, 96.4, 65.5, 45.2, 44.5, 12.7, 12.6. HRMS(ESI):calcd for [M+H]+ (C41H45N6O4) requires m/z 685.3500, found 685.3500.

　　2 结果与讨论

　　2.1 探针RC对金属离子紫外吸收识别性能的研究

　　在探针(10 mΜ)的乙醇测试溶液中，分别加入10 equiv. 的不同的金属离子(Hg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Ag+、Mg2+、K+、Cr3+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Sn2+、Cu2+、Na+)，待光谱变化达到平衡后分别测试加入不同金属离子后的紫外吸收图谱。如图1所示，加入Cu2+后，RC的吸收光谱明显增强并伴随有明显红移，最大吸收从496 nm红移到

　　图1化合物RC(10 μΜ)在乙醇溶液中加入不同的金属离子(10 equiv)后的紫外吸收。

　　Fig. 1UV absorbsance spectra of compound RC(10 μM) in ETOH upon the Addition of

　　10 equiv different metal cations.

　　554 nm，同时裸眼可观察到溶液颜色由橙红色变为紫色。加入Cd2+后，RC的吸收光谱也有红移现象，且最大吸收从496 nm红移到588 nm，同时裸眼可观察到溶液颜色由橙红色变为蓝色。而加入其他金属离子前后RC的紫外吸收没有明显变化。因此，该探针分子对Cu2+、Cd2+的专一性络合作用可以实现裸眼监测。罗丹明B的特征紫外吸收在550 nm左右，实验表明金属离子Cu2+和Cd2+与探针作用后，导致罗丹明内酰胺环开环，从而显示罗丹明B的特征吸收峰。

　　2.2探针RC对金属离子Cu2+和Cd2+的紫外滴定

　　在探针浓度为10 μM的乙醇溶液中，随着Cu2+和Cd2+的浓度(0-20 μM)不断增大，测试紫外光谱的变化。从图2a可以看出随着Cu2+的浓度的增大，在496 nm处的紫外吸收强度逐渐降低，554 nm处的紫外吸收强度明显增强，而且裸眼可观察到溶液颜色由橙红色逐渐变为紫色。从2a插图可以看出紫外吸收强度A554nm/A496nm与Cu2+的浓度(0-10 μΜ)之间有较好的线性关系(R = 0.9893)，最低检测限为5.80×10-6M。同样地，在图2b中，随着Cd2+的逐渐加入，在496 nm处的紫外吸收强度逐渐降低，在588nm处的紫外吸收强度明显增强，同时裸眼可观察到溶液颜色由橙红色逐渐变为紫色，且紫外吸收强度A588nm/A496nm与Cd2+的浓度(0-10 μΜ)之间呈较好的线性关系(R = 0.9738)，检测限为9.19×10-6M。因此，该探针RC能快速、灵敏检测溶液中低浓度的Cu2+和Cd2+，并且可实现检测过程的裸眼观察。

　　图2 (a)化合物RC(10 μΜ)在乙醇溶液中，加入不同浓度的Cu2+(1-20 μM)后的紫外吸收图谱。

　　(b)化合物RC(10 μΜ)在乙醇溶液中，加入不同浓度的Cd2+(1-20 μM)后的紫外吸收图谱。

　　Fig. 2 (a)UVspectra of RC(10 μM) in in EtOH upon addition of increasing amounts of Cu2+ (1-20 μM).Inset: the plot of uv absorbsance spectra intensity A554nm/A496nmversus the concentration of Cu2+andthe colorimetric changes of RC before and after addition 2.0 equiv of Cu2+.(b) UVspectra of RC(10 μM)in ETOH upon addition of increasing amounts of Cd2+(1-20 μM). Inset: the plot of uv absorbsance spectra intensity A588nm/A496nmversus the concentration of Cd2+and the colorimetric changes of RC before and after addition 2.0 equiv of Cd2+.

　　2.3 结合比和结合常数的计算

　　根据Benesi-Hildebrand方程理论，通过探针RC与Cu2+和Cd2+的滴定实验，分别取最大吸光度值554 nn和588nm处，通过归一化曲线1 /(A-A0)与1/[Cu2+]和[Cd2+]进行线性拟合。图3a可以看出1/(A-A0)与1/[Cu2+]有较好的相性关系，线性方程为：y = 1.011213x-0.00143，R=0.9999，表明探针RC与Cu2+为1:1结合，由此可计算得出结合常数k = 6.4402×105。同理，1/(A-A0)与1/[Cd2+]有较好的相性关系，线性方程为：y = 1. 100x-0.44，R = 0.9924，表明探针RC与Cd2+为1:1结合，由式可得出结合常数k = 1.1723×105。

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