摘要：根据GenBank上犬γ-干扰素基因(IFN-γ)序列(序列号WO318193)，利用Primer 5.0软件设计特异性引物，应用RT-PCR技术从100μg/ml ConA刺激24小时后的犬外周血淋巴细胞总RNA中扩增出γ-干扰素基因，测序后应用DNAStar软件对克隆的犬γ-干扰素基因进行序列分析，并与GenBank上发表的犬、牛、大熊猫、鸡、牦牛、人、猪、野猪、斑马鱼、土拔鼠等的IFN-γ基因序列进行同源性比较。结果表明，克隆的犬IFN-γ基因大小501bp，编码166个氨基酸，核苷酸序列同源性分别为98.4%、81.6%、26.1%、26.1%、22.7%、22.7%、80.8%、81.0%、28.5%、25.0%。;氨基酸序列同源性分别为95.8%、72.5%、5.4%、5.4%、6.6%、6.6%、68.9%、69.5%、5.4%、5.4%。

　　关键词：犬;γ-干扰素基因;克隆;序列分析

　　干扰素是在特定的诱导剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,它不仅具有Ⅰ型IFN( IFN-α、IFN-β)的抗病毒和抗肿瘤活性,更重要的是它还具有促进MHCⅡ抗原表达、增强APC细胞与T细胞的相互作用、增强T细胞辅助抗体产生和细胞毒性T细胞产生的能力等诸多免疫调节活性[1]。目前,对动物的IFN-γ基因的研究较多,大多数动物如犬[2,3]、藏獒犬[4]、猪[5]、 野猪[6]人[7]、鸡[8,9]、大熊猫[10]、大鼠[11,12]、牦牛[13,14]、黄牛[15]、水牛[16]的IFN-γ基因已被报道,其中人、猪、牛[17]、鸡、大鼠等IFN-γ已获得重组蛋白，在国内，黄道超[10]成功克隆了大熊猫IFN-γ，夏春[9]于2005年成功克隆了鸡γ-干扰素，景志忠[13]于2008 年成功克隆牦牛γ-干扰素基因，但对犬IFN-γ基因(CaIFN-γ)的研究还未见报道。本研究应用RT-PCR技术，从ConA刺激24小时的犬外周血淋巴细胞中克隆IFN-γ基因，并对其序列进行分析，以期为进一步研究犬IFN-γ基因的体外表达和生物学活性检测以及免疫疫苗的奠定基础。

　　1.材料与方法

　　1.1 实验材料

　　犬(土狗)外周血采自蒙自大园梓路鸿泰狗肉米线馆，取50ml左右血液于预先加入1ml的肝素钠溶液(10mg/ml)的无菌离心管中，摇匀，备用。

　　1.2菌株与质粒

　　大肠杆菌E.coli DH5α细胞为本校实验室保存，pMD18-T Vector 购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司

　　1.3犬外周血淋巴细胞的分离与培养

　　采用密度为1.080的淋巴细胞分离液分离犬外周血淋巴细胞，将分离的淋巴细胞密度调至5×106个/ml，终浓度为30μg/ml的ConA，0.5%CO2 ，37℃的二氧化碳培养箱中培养18h。

　　1.4犬淋巴细胞总RNA的提取

　　将培养18h后的淋巴细胞，4℃2000r/min离心3min。弃上清，加1mL Trizol试剂，一步法提取总RNA，具体方法参照《分子克隆实验指南》[15]。

　　1.5犬GM-CSF基因的RT-PCR扩增

　　按照Fmerntas公司的RT试剂盒说明操作合成cDNA，再根据GenBank上Nash,R.A.等发表的犬GM-CSF cDNA序列(NM_00 1003245)设计一对特异性引物, 引物如下：P1：5’-GCGAATTCTTATTTCGATGCTCTGCGG -3’，P2：5’-CGGGATCCATGAATTATACAAGCT-3’

　　然后进行PCR的扩增，PCR反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸30s,循环扩增30次;最后72℃延伸10min，扩增结束后取10µL产物进行电泳检测。

　　1.6 基因的亚克隆

　　将回收后的PCR产物4.5µL与载体PDM18-T Vector 0.5µL相连接，并加入Ligation Solution1 5.0µL。转化JM109感受态细菌，经含有氨苄青霉素的平板筛选培养，挑取菌落，提取重组质粒。

　　1.7 重组质粒的鉴定

　　将提取的重组质粒进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定和PCR鉴定。

　　1.8 犬γ干扰素(CaIFN-γ)基因的序列测定和分析

　　将鉴定为阳性的菌液送交上海生工测序，应用DNAstar软件对测定的黄牛IL-2基因进行序列分析、同源性比较和进化树分析。

　　2.结果

　　2.1CaIFN-γ基因的RT-PCR扩增

　　取PCR产物5μl经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，显示有一条约500bp左右的条带，与预计的片段大小一致(图1)

　　2.2重组质粒的双酶切鉴定

　　重组质粒经EcoRI/BamHI双酶切鉴定，结果显示有一条约2500b p的载体大片段和一条约500bp的目的片段,大小均与预计相符，说明CaIFN-γ基因已重组到载体中(图2)。

　　图2pMD18-T-CaIFN-γ重组质粒的双酶切鉴定

　　1. DL2000 Marker

　　2. pMD18-T-CaIFN-γ重组质粒EcoRI/BamHI双酶切结果

　　2.3CaIFN-γ基因的序列测定及分析

　　鉴定为阳性的菌株，经大连宝生物公司测序后，得到了CaIFN-γ基因的全序列(图3).该基因全长501bp,编码166个氨基酸。与Genbank中发表的犬CaIFN-γ基因序列比较有八个位点不一致，从第一位起始密码子开始分别为第24、103、106、203、 284、 384、 408和455位。

　　图3 CaIFN-γ基因序列测定结果

　　2.4CaIFN-γ编码的氨基酸序列分析

　　CaIFN-γ的序列及其氨基酸分析如图4，预测分子量为19382.38D，等电点为9.211。用DNAStar 进行分析确定IFN-γ基因全长501bp，编码166氨基酸。

　　图4 CaIFN-γ基因编码的氨基酸序列分析

　　2.5CaIFN-γ基因同源性比较和进化树分析

　　利用DNAStar软件将克隆得到的CaIFN-γ基因与国外报道的犬和牛、大熊鸡、牦牛、人、猪、野猪、斑马鱼、土拔鼠等γ-IFN基因序列进行同源性比较和进化树分析后发现，犬与国外报道的犬γ-干扰素基因的同源性极高，达到98.4%。而与其它动物的γ-干扰素的同源性却比较低，只在22. 7 %-81.6%之间(图5)。进化树分析后发现犬与牛、猪、野猪γ-干扰素基因的进化关系最接近，从这一点看，可以间接表明克隆结果是正确的(图6)。

　　图5 克隆的CaIFN-γ基因与其他动物IFN-γ基因的同源性比较

　　图6 克隆的CaIFN-γ与其他动物IFN-γ基因进化树分析结果

　　2.6CaIFN-γ基因编码的氨基酸序列与其它动物IFN-γ基因编码的氨基酸序列同源性比较和进化树比较

　　将克隆的CaIFN-γ基因编码的氨基酸与国外报道的犬、牛、大熊猫、鸡、牦牛、人、猪、斑马鱼、土拔鼠等IFN-γ基因编码的氨基酸序列进行同源性比较与进化树分析，并用DNAStar对其编码氨基酸序列进行蛋白质二级结构预测，结果发现，氨基酸的同源性与基因的同源性差异不大(图7)，进化基本来自四个分支(图8)。其编码蛋白的空间结构具有5个α螺旋，21个β折叠，9个γ转角和4处无规则卷曲，其编码的蛋白质具有一定的亲水性，但不是很强(图9)。

　　图8 CaIFN-γ基因推导氨基酸与其他动物IFN-γ基因的推导氨基酸同源性分析

　　图9 CaIFN-γ基因推导氨基酸与其他动物IFN-γ基因的推导氨基酸进化树分析

　　图10FN-γ基因序列的二级结构预测

　　3.讨论

　　近年来, 随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展,大量的细胞因子得以克隆,许多细胞因子基因工程药物面向市场, 给治疗畜禽疾病提供了新的手段,同时创造了巨大的经济和社会效益。

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