摘 要：秸杆直接还田会给作物生长带来不利影响，在还田过程中补加纤维素降解菌剂是解决其不利影响的有效方法。本研究通过平板初筛及酶活综合测定及秸杆降解率测定复筛，从腐烂秸秆、牛粪堆肥、森林土等样品中筛选到5株高效纤维素降解菌，其中X1菌的酶活最佳，酶系组成最合理，其Cx，Cb，C1和FPA分别达到53.6 U，69.7 U，9.5 U和11.6 U，对秸秆的降解率达40.2 %。进一步进行菌种组合，得到了一组秸秆降解率有明显增加的复合菌X1+X2，其降解率达到45.5 %。根据X1和X2的菌落及个体形态特征，初步判定其均为青霉菌。

　　关键词：秸秆还田;纤维素降解;筛选;菌种组合

　　中图分类号：S19

　　The Screening of Straw-decomposing Microorganism and Strain Combination

　　Abstract: Straw returning to farmland directly has negative effects for seed germination and crop growth, high-efficient cellulose-decomposing bacteria is an effective method to resolve this problem.Five strains with different cellulase composition were isolated from rotten straw, cow dung compost, and paddy soil. One of the five strains which named X1 had the maximum cellulose activity and cellulose composition. In this study the Cx，Cb, C1and FPA of X1 were 53.6 U, 69.7 U, 9.5 U and 11.6 U, and straw degradation rate up to 40.2%. The degradation rate of combination strains X1 and X2 up to 45.5%, which higher than the others combination strains. According to the morphological characteristics of X1 and X2, we deduced that they were Penicillium.

　　key words：Straw Returning;Cellulose degradation;Screening;StrainCombination

　　是我国实施“沃土工程”，不断提高耕地质量，实现农业可持续发展的重要措施，也是解决秸秆焚烧问题的有效方法，但简单的直接粉碎还田，秸秆会同作物争水争肥，作物出现出苗率低、苗弱、死苗现象[1]，给农业生产带来不利影响。在还田过程中添加纤维素降解菌促进秸秆降解是解决这一问题的有效方法之一。

　　秸秆主要组分包括纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素是制约秸秆降解的重要因素。纤维素的降解是Cx酶(也称内切型葡聚糖酶，CMC酶)，C1酶(也称外切型葡聚糖酶，微晶纤维素酶)和Cb酶(也称纤维素二糖酶，β-葡萄糖苷酶)等酶协同作用的结果[2]，以往的研究一般只侧重其中部分酶活性的测定，难以全面了解菌种的降解酶系，往往存在酶组分比例不协调等问题[3]，本试验尝试以多种纤维素酶活性作为菌种的筛选指标，以期得到到酶活性较高，酶组分比例协调的菌种，对高效纤维素降解菌的筛选方法做了进一步探索。进一步利用菌种之间的协同作用，将筛选到的菌种进行组合，以得到纤维素降解能力更强的菌种组合。

　　1 材料与方法 菌种来源 菜园土，森林土，稻田土、朽木、腐烂秸秆和牛粪堆肥。 培养基 富集培养基：K2HP04 2 g，(NH4)2SO4 1.4 g，MgS04.7H20 0.3 g，CaCl2 0.3 g，FeSO4.7H2O 5 mg，MnS04.H2O 1.6 mg，ZnS04 1.7mg,CoCl2 2 mg，秸秆粉2%，蒸馏水1 000 mL，121 ℃、0.1 MPa高压灭菌30 min。

　　刚果红纤维素鉴别培养基：(NH4)2SO4 2 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0.5 g，CMC-Na 20 g，刚果红0.2 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 ml，自然pH值，于121 ℃、0.1 MPa下灭菌30 min。

　　液体产酶培养基：秸秆粉与麸皮质量比4：1混匀，取2 g加入250 ml三角瓶中，每瓶再加入100 ml Mandels营养液。自然pH值，于121 ℃、0.1 MPa下灭菌30 min。

　　Mandels营养液：(NH4)2SO4 1.4 g，KH2PO4 2 g，尿素0.3 g，MgSO4. 7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g,FeSO4.7H20 7.50 mg，MnS04.H2O 2.50 mg，ZnS04 2.0 mg，CoCl2 3.0 mg，水1 000 ml.

　　固体产酶培养基：秸秆粉与麸皮质量比4：1混匀，每克固体加入3 ml营养液，pH自然，每250 ml三角瓶瓶装入20 g培养基，自然pH值，于121 ℃、0.1 MPa下灭菌30 min。

　　秸秆降解率测定培养基：新鲜玉米秸秆晾干劈开成四瓣，剪成1 cm见方的块，称取4 g加入150 ml的三角瓶，每瓶再加入12 ml的营养液，混合均匀，自然pH值，于121 ℃、0.1 MPa下灭菌30 min。

　　营养液的配制：(NH4)2SO4 20 g，尿素3 g，蛋白胨3g，CaCl2 0.1g，MgSO4.7H2O 50 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0.1 g，FeSO4.7H2O 0.05 g，MnSO4.7H2O 0.016 g，ZnSO4.7H2O 0.014 g，CoCl2 0.02 g，水1 000 ml，自然pH值。 试验方法 菌种富集 称取菌种来源样品5 g，加入以秸秆为唯一碳源的100 ml富集培养基中，28 ℃恒温震荡培养一周，吸取5 ml培养液转入新的富集培养基，富集三代。 菌种初筛 取富集三代的培养液适当稀释，在刚果红鉴别固体培养基上分离纯化菌种，斜面保存。 菌种复筛 液体产酶试验：将初筛菌种分别接入液体产酶培养基，30 ℃振荡培养4 d，过滤酶液，测定pH和酶活。

　　固体产酶试验：将初筛的菌种分别接入固体产酶培养基，30 ℃静置培养5 d后，每瓶加50 mL蒸馏水摇匀后静止2小时，测定酶液pH和酶活。 酶活性测定 采用DNS还原糖法测定各纤维素酶活性。纤维素酶活性定义:1 mL酶液于50 ℃，pH 4.8条件下，每分钟水解底物产生1 µg还原糖(以葡萄糖计)的酶量定义为1个酶活力单位。

　　FPA活力单位的测定：取两支25 ml刻度的试管，各加0.2 ml酶液，再加pH 4.8醋酸缓冲液1.8 ml。测定管加入1×6 cm滤纸条，充分浸泡置50 ℃恒温水浴60 min，空白管同时置50±0.5 ℃恒温水浴60 min。然后分别加入DNS显色液2 ml，空白管同时加1×6 cm滤纸条。 沸水浴10 min，冷却后加水至15 ml，以空白管调零点，在550 nm测OD值。

　　Cx活力单位的测定：取两支25 ml刻度的试管，各加0.2 ml酶液。测定管加1.8 mlCMC(1%)，另空白管只加pH4.8醋酸缓冲液1.8 ml。然后置5恒温水浴60 min。然后分别加入DNS显色液2 ml。放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15 ml，以空白管调零点，在550 nm测OD值。

　　C1酶测定则只用把FPA酶活测定中的滤纸条换成50 mg的脱脂棉，Cb酶测定需把CMC酶活测定中的CMC(1%)换成水杨素(1%)

纤维素酶活力=U/ml

　　式中，x:样品OD值的平均值;a和b：由葡萄糖浓度和相应的OD值通过回归方程求得;n：酶液的稀释倍数;T：酶促反应的时间;0.2：所加酶液的量。

　　1.3.5 菌种组合

　　将筛选得到的菌种进行两两组合和三三组合，接入秸杆降解率测定培养基，测定菌种的秸秆降解率。

　　1.3.6 秸秆降解率测定

　　将菌种接种于秸秆降解率测定培养基，28 ℃静止培养10 d，定期摇匀。将降解过的秸秆用蒸馏水冲洗，除去菌体，将残留物过滤，105 ℃烘干后称重，以不接菌的为对照，失重法计算秸秆降解率。

　　1.3.7菌种形态观察

　　菌落形态观察：平板划线接种，30 ℃培养，观察菌落边缘、表面质地及颜色等形态特征。

　　载片培养观察孢子和菌丝形态：按文献3中的方法对所筛选菌种进行显微观察[4]。

　　2.试验结果

　　2.1 菌种初筛结果

　　将来自于堆肥、森林土、菜园土、腐烂秸秆等处的样品在以秸秆为唯一碳源的培养基中进行三代富集，再经过刚果红鉴别培养基筛选，共筛到真菌32株，细菌12株，放线菌4株，将菌种斜面保存。

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