正文：摘要：［目的］本研究开展了SELEX技术中ssDNA文库不对称PCR扩增及回收条件的优化试验，该研究结果为今后运用SELEX技术筛选特异性核酸适体奠定了技术基础。［方法］以对称PCR最佳退火温度为基础，优化不对称PCR循环数和上下游引物比例，并运用三种不同的PCR产物纯化方法比较其回收效率，确立ssDNA文库不对称PCR的最佳循环条件和纯化方法。［结果］20 μL不对称PCR反应体系中上下游引物的最佳比例为60:1，最优循环数为30个循环，回收效率最高的方法为乙醇沉淀法。此条件下，随机ssDNA文库不对称PCR扩增条带清晰、稳定、特异性高，并具有较好的纯化效率。
关键词：SELEX；ssDNA文库；不对称PCR；DNA纯化
Optimization of Asymmetric PCR Reaction System and Purification of Random Single-srtand DNA Library
Abstract：The asymmetric PCR amplification and purification methods of ssDNA library used in SELEX technology were optimized in this study.On the basis of optimized symmetry PCR reaction system of the dsDNA library,different ratios between forward and reverse primer and the cycle numbers were used and compared.The efficiency of three purification methods for amplified ssDNA library were also conducted and compared.The result showed the optimal number of cycles was 30,and the optimal ratio between forward and reverse primer was 60:1.Under above PCR conditions, clear and stable bands of ssDNA library amplified was seen. Ethanol precipitation method had the highest purification efficiency among the three methods compared.This experiment laid technical foundations for selection of specific aptamers of target material in SELEX.
Key words：SELEX ;ssDNA library; asymmetric PCR ; DNA purification
1 前言
20世纪90年代诞生了一种新兴的科学技术，它利用人工合成的大容量随机寡核苷酸文库与靶分子在体外的相互作用，筛选出一种与传统抗体相比特异性更强、亲和力更大、性质更稳定以及制备更容易，无免疫原抗性，无批间差异的适配子（Aptamer）
[1]。该技术称之为指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)。SELEX技术打破了传统的核苷酸配对的思想，称得上是核酸研究与应用的里程碑似进步。其原理是利用大容量的随机单链寡核苷酸文库进行体外多轮筛选、扩增并最终获得与非核酸靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列
[2]。SELEX技术筛选出的适配子不仅分子量小、配体广泛、体外筛选不依赖于实验动物，甚至可以进行多种修饰，比如最为普遍的糖环修饰、碱基修饰和磷酸修饰等
[3]，这些优势使得SELEX技术有望成为实验室和临床诊断、治疗的主要技术之一。随机寡核苷酸是SELEX筛选技术的基础，而随机寡核苷酸链中间存在一段随机序列，由于该随机区的存在使文库中的核酸序列极为丰富，给筛选过程中文库的PCR扩增带来了一系列的问题，导致非特异性扩增
[4]，得不到理想的随机ssDNA，而常规的试剂盒回收方法对小片段分子回收效率极低，影响整个筛选过程。针对上述问题，本试验在对称PCR最佳优化条件的基础上对随机ssDNA文库的不对称PCR反应体系进行优化，并且比较了PCR产物不同纯化方法的回收效率，以期为SELEX技术中构建亚文库以及筛选特异性更强的适配子奠定基础。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验材料
随机ssDNA文库：构建长度为80 nt的随机ssDNA文库，ssDNA文库：5'-CTG GAG CGT CCT GGG GCG TC N(40) GTG CCC TCG CTC CGA CCA GC-3'，两端为固定序列，中间N40为随机序列。
PCR扩增引物：上游引物5'-CTG GAG CGT CCT GGG GCG TC-3'，下游引物5'-GCT GGT CGG AGC GAG GGC AC-3'，随机库及引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
2.1.2 试验试剂
MgCl
2、Taq DNA Polymerase、dNTP、10×PCR Buffer均购自大连宝生物工程有限公司。
异丙醇、4 mol/L醋酸铵、70%乙醇、酚：氯仿（1：1）、3 mol/L醋酸钠、无水乙醇。
2.2 方法
2.2.1 随机ssDNA文库与合成引物的质量鉴定
设计好的引物和ssDNA文库交与上海英骏生物技术有限公司合成。合成的引物序列和随机ssDNA文库采用4%琼脂糖凝胶电泳对其进行质量鉴定。
2.2.2 不对称PCR条件优化
在前期随机ssDNA文库对称PCR反应体系
[5]优化结果的基础上，参照文献
[6]报道的方法对随机ssDNA文库的不对称PCR扩增体系进行优化，拟定的反应体系及循环条件如下：
(1)反应体系：
10×PCR Buffer 2.0 µL
25mM MgCl
2 2 .5 mmol/L
dNTP Mixture 0.25 mmol/L
上游引物 12 µmol/L
下游引物 0.6 µmol/L
Taq DNA Polymerase 1.5 U
ssDNA模板 2.5 ng
无菌水 补至20 µL
(2)循环条件：
94℃预变性30s，94℃变性30s，68℃退火30s，20个循环，最后72℃延伸15s，最后72℃温育7min。
其他反应组分与反应条件相同，固定下游引物投入量（0.6μmol/L），以不同上、下游引物比例（1：1、20：1、40：1、60：1、80：1、100：1）分别扩增20、30个热循环次数，进行3次平行试验以验证其稳定性。
(3)产物鉴定：
PCR产物采用4%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2.3 PCR产物回收
以2.2.2中确立的最佳循环次数和上下游引物比例进行不对称PCR扩增，PCR扩增产物分别采用下列三种方法进行回收纯化试验并比较其回收效率。
(1)商品化试剂盒提取
4%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，待片段完全分离后，在紫外光下切取所需条带，DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s，准确称取凝胶块的重量，按照1g/mL Binding Buffer对应量，加入适量体积的Binding Buffer，55-60℃水浴溶解（约7-10min），每隔2-3min振荡一次。溶解完成后，将DNA/凝胶混合液转移到套有收集管的HiBind DNA柱子上，10,000×g离心1min，倒去滤液，把柱子装回收集管，加入300 μL Bind Buffer，按上述条件离心，弃去滤液，把柱子重新装回收集管，加入700 μL SPW Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液，13,000×g离心空柱2min以甩干柱子基质。将柱子装在干净的EP管中，加入30-50 μL 65℃预热的Elution Buffer到柱子基质上，室温静置2min后≥13,000×g离心2min洗脱出DNA。回收产物加20 μL DEPC水重悬，置于4℃冰箱备用。
(2)乙醇沉淀法
[6]
吸取100 μL PCR产物12,000×g离心4min，吸取上清液于1.5 mL EP管中，向上清液中加入等体积的酚：氯仿（1：1），混匀，置离心机中12,000×g离心5min，吸取上清液于另一干净的1.5 mL EP管中，加入0.1倍体积3 mol/L醋酸钠，混匀后加入2倍体积的无水乙醇，再次混匀，置于-26℃过夜。取出后12,000×g离心30min，弃去上清液，加入1 mL 70%乙醇于室温洗涤沉淀样品，5,000×g离心5-10min后弃去上清液，敞开管盖，置于室温，直至乙醇完全挥发，沉淀的DNA样品加入DEPC水20uL重悬后置于4℃冰箱备用。
(3)不完全沉淀法
[7]
吸取100 μL PCR产物于干净的EP管中，加入等体积4 mol/L醋酸铵溶液，振荡混匀，再加等体积的异丙醇，振荡混匀，室温静置10 min，然后以12,000×g / min离心10 min，去上清，加70%乙醇1 mL 漂洗，振荡，5,000×g /min离心5-10min，弃去上清液，再加70%乙醇1 mL 振荡混匀，4℃下12, 000 ×g离心5 min，吸弃上清，室温下干燥，加20 μL DEPC水重悬，置4℃冰箱备用。
2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测回收效率及DNA浓度测定
分别吸取三种不同纯化方法的纯化产物各5μL进行4%琼脂糖凝胶电泳，检测回收效率，并测定回收前后DNA的浓度和OD260/OD280比值。
3 试验结果
3.1 随机ssDNA文库及引物合成产物的质量鉴定
通过4%琼脂糖凝胶电泳，得到如图1的条带，PCR扩增结果与预期相符，条带单一，纯度好，符合要求。
图1 随机ssDNA文库及引物合成产物扩增结果 Marker为20bp Ladder Marker，1为文库，2、3为引物。
3.2 不对称PCR扩增条件优化
通过4%琼脂糖凝胶电泳鉴定分析，以既有较高的扩增效率又有较单一目的条带的扩增条件为最优上、下游引物比例和循环次数。结果显示：随机ssDNA不对称PCR扩增的最佳循环次数为30（图2、图3），最佳上、下游引物比例为60:1（图3）。
图2 热循环次数20，泳道1-6引物比例分别为1：1、20：1、40：1、60：1、
80：1、100：1。退火温度为68℃，Marker为20bp Ladder Marker。
图3 热循环次数为30，泳道1-6引物比例分别为1：1、20：1、40：1、60：1、
80：1、100：1。退火温度为68℃，Marker为20bp Ladder Marker。
3.3 待回收产物鉴定
取三组PCR样品各8 μL，Marker 3 μL进行4%琼脂糖凝胶电泳，结果显示：3组样品条带亮度一致，符合要求（图4）。
图4 泳道1、2、3为回收前产物各8 μL，
Marker 3 μL，Marker为20bp Ladder Marker。
3.4 回收产物检测
通过4%琼脂糖凝胶电泳检测商品化试剂盒、乙醇沉淀法、不完全沉淀法回收所得产物，以随机ssDNA文库PCR产物出现清晰的单一条带、回收效率最高的纯化方法为最佳回收方法。结果显示：不完全沉淀法、乙醇沉淀法、商品化试剂盒法对短片段ssDNA回收效率最佳的是乙醇沉淀法，其次是不完全沉淀法，最后为商品化试剂盒法（图4）。
通过核酸蛋白测定仪测定回收前后ssDNA浓度，其结果如表1，比较三种方法的回收效率显示，乙醇沉淀法与不完全沉淀法差异显著，乙醇沉淀法与商品化试剂盒法差异极显著，不完全沉淀法和商品化试剂盒法差异极显著。
紫外分光光度计下测定三种方法回收产物的OD260/0D280值，其结果如表1，当0D260/OD280=1.6 ~1.8时，可以认为该ssDNA纯度较好，由表1可知，三种纯化方法所得纯化产物质量均在标准范围以内，其中乙醇沉淀法的纯化效率最高。
图4 泳道1为回收前产物（5μL），2为乙醇沉淀法，3为不完全沉淀法，4为商品化试剂盒法（均5μL），Marker（3μL）为20bp Ladder Marker。
表1：三种纯化方法结果的比较
Table 1：the comparison of three methods of purification
注：*表示与试剂盒提取法相比较差异显著（p<0.05），**表示与试剂盒提取法相比较差异极显著（p<0.01），
★表示与不完全沉淀法相比较差异显著（p<0.05）。
4 分析与讨论
1990年，Gold L和Elligton ADt
[8]同时报道了一种应用大容量的随机单链寡核苷酸文库进行体外筛选、扩增的技术，理论上讲，通过这项技术可以得到与任何特定非核酸靶分子高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列。该技术被命名为指数富集的配基系统进化技术(SELEX)。SELEX技术自问世以来，发展十分迅速，采用该技术筛选的适配子已经不断应用于疾病诊疗、药物研究等生命科学的各个方向。理论上，SELEX技术结合PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异性结合的寡核苷酸，经过几轮甚至十几轮的筛选，可以获得亲和力高、特异性好的靶分子，但是在实际操作中还是存在筛选效率低的问题。
PCR技术始终贯穿着适配子筛选的全过程，PCR扩增效率的高低也会直接影响适配子的特异性和高效性，制备下一轮筛选文库的方法一般有不对称PCR法和生物素-链亲和素磁珠分离法
[9]，虽然应用磁珠法获得的ssDNA纯度好，但是磁珠法耗材较为昂贵，不为实验室所广泛采用，因而成本较低、方法简单的不对称PCR法应用更为广泛。同时，随机ssDNA文库随机区的存在也使得文库具有多样性，当以ssDNA为模板进行PCR扩增时，随着循环次数的增加，非特异性扩增产物也会增加
[10]。为保证亚文库的纯度和数量，不对称PCR扩增条件的优化就显得尤为重要，尤其是循环次数和上下游引物比例的优化。本试验中，以30个循环为最佳热循环次数，既可以获得高质量的ssDNA文库，又能较好的避免非特异性产物的扩增且试验结果稳定。
从图2、3中可以看出，在相同的PCR扩增条件下，20个热循环所扩增出来的产物条带亮度明显低于30个热循环扩增产物，从图3可以看出，当上下游引物比例为60：1时，条带单一，亮度高，而当上下游引物比例为80：1时，试验结果也较为理想，但是试剂用量多于上下游引物比例为60：1时，从经济方面考虑，本试验中最佳上下游引物比例结果为60：1。在一般的不对称PCR扩增中，合适的上下游引物比例一般为50-100：1之间，符合一般扩增条件，过低的引物比例容易引起非特异性扩增，而过高的引物比例则会使扩增效率下降
[11]。
PCR扩增产物中一般都含有过量的酶和引物等，会影响后续的连接、筛选等操作过程
[12]，因而扩增产物的纯化是非常有必要的。常规的回收纯化方法一般为商品化试剂盒提取，但是试剂盒对＜500bp的目的片段的回收效率非常低，而且商品化试剂盒价格昂贵，乙醇沉淀法利用苯酚作为蛋白变性剂，由于蛋白质和DNA的连接结已经断裂，而且蛋白质分子表面有许多与苯酚相似相容的极性基团，所以蛋白质溶于酚相，核酸溶于水相，离心后取含有核酸的上清液，再利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇将核酸沉淀下来。不完全沉淀法和乙醇沉淀法原理类似，异丙醇和乙醇都是有机溶剂，在室温下异丙醇沉淀对去除多糖、杂蛋白的污染更为有效，但是异丙醇容易使盐类和DNA共沉淀，而且异丙醇难以从沉淀的DNA溶液中去除，因此需要用乙醇多次洗涤
[13]，而乙醇对盐类的沉淀少，易于挥发。DNA纯度的测定则是根据OD260/OD280比值判定的，当0D260/OD280=1.6~1.8时，可以认为该ssDNA纯度较好，当OD260/OD280＜1.6时，表明该产物有蛋白质、酚等污染，当OD260/OD280＞1.9时，则表明有RNA污染，三种常规回收纯化方法所得产物均符合一般纯化要求，相互间差异不显著。本研究结果表明乙醇沉淀法对小片段DNA分子的回收效率及纯化效果均比较好，但是不能完全分离产物中的单双链，导致回收产物中仍含有dsDNA，试剂盒提取法所得产物中，含有dsDNA较少，却存在回收效率低的问题，三种常规方法各有优缺点，
5 结论
本次研究中得到20 μL体系ssDNA文库不对称PCR最佳扩增条件为30个热循环，上下游引物比例为60：1，在此条件下可以得到单纯、无特异性扩增的ssDNA目的条带。乙醇沉淀法对小片段（80nt）目的DNA的纯化效果较好，对后续构建亚文库有重要的作用。
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《小学语文教师》
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《武大国际法评论》
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