摘要：为建立一种简便、快捷、灵敏的CS的测定方法，研究了天青Ⅰ染色剂直接测定CS含量的分光光度法，二者能特异性结合成蓝紫色复合物，该复合物在特定波长处有最大光吸收，通过测定吸光度值可测CS含量。结果天青Ⅰ-CS复合物在波长547nm处有最大光吸收，且在10mg/L~100mg/L范围内，具有良好的正相关线性关系，回归方程是y = 0.0404x + 0.2483，R2=0.9937;该测定方法在5h内稳定性、重现性测定结果P﹥0.05，说明数据可靠，加样平均回收率达94.34%，是一种简便、快捷、灵敏的测定方法。

　　关键词：分光光度法;硫酸软骨素;测定;天青Ⅰ

　　硫酸软骨素(Chondronitin Sulfate，CS)是一种广泛存在于动物软骨组织中的酸性粘多糖【1】。以蛋白聚糖聚集体形式存在于软骨、腱、韧带和主动脉等组织的基质中，由20~60个D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基己糖以1，3糖苷键连成的重复二糖组成【2、3】。广泛应用于食品、医药和化妆品行业中，能防治关节炎【4、5】，

　

　　高血脂【6】、牛皮癣【7】等疾病并能促进生发【8】。在食品工业上，CS是具有保健功能的新型天然食品添加剂【9】、增稠剂，如果营养中缺少，皮肤就容易起皱纹。

　　因其安全性、可靠性高，近年来消费需求量急剧飙升。

　　从现有测定方法看，利用其软骨素二糖、氨基己糖、葡萄糖醛酸、硫酸基、阴性基团等分子结构单位可以直接或间接的测定CS含量【10】。以软骨素二糖为指标的方法如潘自国等人【11】是先将CS降解成软骨素二糖单位，通过HPLC或RP-HPLC法测定，间接得到CS的含量，该方法的缺点是由于受前期降解程度的影响，其准确度值得商榷，而且操作繁琐，不适合广泛应用;以氨基己糖、葡萄糖醛酸和硫酸基为测定指标的方法原理相似，均需要将CS降解，如陆钊等人【12】所用咔唑法、间苯三酚法【13】以及Elson-Morgan法【14】，多是以强酸降解CS的糖链，将其分子中的氨基己糖、葡萄糖醛酸或硫酸基等基团暴露并与成色物质结合，通过测定溶液特征吸光值，再根据各基团与软骨素二糖单位的分子量之比换算间接得到CS含量，该类测定方法操作虽比前述方法简便，但是结果仍然受CS降解程度影响并受含相同基团的外来杂质影响较大，其准确度仍值得商榷;而以阴性基团为基础的方法主要有结晶紫分光光度法【15】、维多利亚蓝B分光光度法【16】、吖啶橙分光光度法【17】、中性红分光光度法【18】和碱性艳蓝BO分光光度法【19】等，是利用阳性染料或乳化剂与CS分子中羧基和硫酸基等阴性基团反应结合成复合物，复合物有特征吸收值，从而测定CS含量。该类方法属于直接测定法，操作较为简便，但受复合物结合强度和稳定性的影响，重现性和稳定性低，从而结果准确性低。

　　天青Ⅰ是一种生物染色剂，呈绿色光泽的深棕色结晶，在水溶液中呈蓝色，微溶于乙醇显红棕色荧光。带正电荷，而CS的硫酸根和羧基带负电荷，二者通过静电引力相互作用，形成稳定的天青Ⅰ-CS复合物并发生变色，且有其特征吸收光谱。

　　笔者利用天青Ⅰ试剂能与CS特异性结合形成具有特征光吸收的蓝紫色复合物的性质，建立了一种简便、快捷、灵敏的测定CS含量的分光光度法。

　　1. 仪器和药品

　　药品：硫酸软骨素标准品(Sigma公司，含量>99%);天青Ⅰ染色剂(Azure Ⅰ，AⅠ，BS，国药集团化学试剂有限公司);猪CS样品(自制);硫酸软骨素注射液(西安博森制药，规格2ml/支，含量为1.40mg);康得灵复方片(上海实业联合集团长城药业有限公司，规格0.12g/片)。

　　仪器：紫外分光光度仪(TU-1810S 北京普析通用仪器有限责任公司);

　　2. 方法

　　2.1 溶液配制

　　天青Ⅰ储备液：称取天青Ⅰ染色剂5.0000g，溶解定容至100ml，4℃冰箱中静置1w以上，过滤备用。

　　天青Ⅰ应用液：取制备好的天青Ⅰ储备液2ml，定容至100ml。

　　CS标准溶液：称取1.0000gCS标准品，定容至100ml。

　　CS样品溶液：称取110℃下干燥至恒重的猪CS样品1.0000g，定容至100ml。

　　注射液待测样品液：取硫酸软骨素注射液1ml，蒸馏水稀释至10ml;

　　康得灵复方片待测样品液：取康得灵复方片一片，少量蒸馏水溶解，过滤掉不溶物，滤液定容至250ml，取5ml，定容至100ml。

　　2.2 天青Ⅰ吸收光谱测量

　　取1ml天青Ⅰ应用液稀释后在波长500~800nm范围内扫描其吸收光谱。

　　2.3 标准曲线绘制

　　将CS标准溶液稀释，得到10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L和100mg/L等系列稀释液。取1ml 稀释液，加入5ml天青Ⅰ应用液充分混匀后，静止反应15min，以蒸馏水作空白，在特征吸收波长下测吸光度值OD。吸光度值做纵坐标，浓度做横坐标制作标准曲线。

　　2.4 稳定性试验

　　取浓度为100mg/L的CS稀释液，室温下每30min测定OD547一次。

　　2.5 重现性测定

　　选择CS标准溶液稀释液浓度100mg/L、50mg/L和10mg/L，分别重复测定10次。

　　2.6 回收率测定

　　取10ml具塞试管7支，分别加入50mg/L的猪CS样品溶液0.20ml，2~4号管各加入浓度为1.0g/LCS标准溶液0.20ml，5~7号管各加入CS标准溶液0.10ml，重复测定OD547，计算回收率。

　　结果和分析

　　3.1.1 测定波长的确定

　　吸光度值A

　　波长/nm

　　图1 天青Ⅰ吸收光谱曲线

　　吸光度值A

　　波长/nm

　　图2 天青Ⅰ-CS复合物的吸收光谱

　　天青Ⅰ试剂在615nm处最大光吸收，如图1。天青Ⅰ试剂与CS特异性结合的蓝紫色复合物在547nm处有最大光吸收峰，如图2。从吸收光谱图中可以看到天青Ⅰ和天青Ⅰ-CS复合物有部分吸收重叠，在实际应用时，由于在其最大吸收波长处的最大吸收波长天青Ⅰ应用液本身就比天青Ⅰ-CS复合物的吸光度值低，加上在天青Ⅰ-CS复合物的形成过程中会消耗大部分游离的天青Ⅰ，因此该重叠对测定结果的影响可以忽略不计。因此该方法选择在波长547nm处测吸光度。

　　3.1.2 线性相关性研究

　　将CS标准溶液稀释液在浓度1~400mg/L的范围内研究了与天青Ⅰ试剂显色后的线性关系。按照2.3所述方法绘制曲线，如图3~6：

　　图3 CS浓度1~400mg/L范围内线性研究

　　图4 CS浓度1~10mg/L范围内线性研究

　　图5 CS浓度10~100mg/L范围内线性研究

　　图6 CS浓度100~400mg/L范围内线性研究

　　结果显示：10~100mg/L 范围内，回归方程是y = 0.0404x + 0.2483，R2=0.9937，线性相关性良好;故选取10~100mg/L 范围绘制标准曲线，进行CS含量测定。

　　3.2 显色稳定性

　　图7 稳定性测定

　　稳定性测定结果如图7。结果显示每30min所测得数据的平均值之间P﹥0.05，表明在5h内，天青Ⅰ-CS复合物的吸光度值的平均值之间没有显著差异，即稳定性很好。

　　3.3 重现性

　　选择CS稀释液浓度为100mg/L、50mg/L和10mg/L三个系列溶液，进行重复测定10次。结果如图8。

　　图8 重现性测定

　　由图可知，同一个系列浓度的测定结果之间P﹥0.05，差异不显著，故每个系列浓度的重现性都很高，说明测定方法的重现性良好并不受待测样品浓度影响。

　　3.4 回收率测定【20】

　　根据2.6中所述方法测得CS加样回收率的结果如表1。

　　表1 CS加样回收率试验结果(n=3)

　　编号 加标准量 测得CS 回收率 平均回收率 RSD

　　mg mg/L % % %

　　1 0.0000 35.0 - - -

　　2 0.2000 491.5 94.98

　　3 0.2000 489.7 94.53

　　4 0.2000 485.3 93.78 94.34 1.45

　　5 0.1000 343.6 96.34

　　6 0.1000 335.6 94.09

　　7 0.1000 328.9 92.21

　　由表中数据分析可得，该方法具有较高的回收率。加样平均回收率达94.34%

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