摘要：[目的]建立保健食品总黄酮含量测定的超声提取最佳条件。[方法] 采用单因素分析法和正交试验法，以保健食品总黄酮含量为考察指标，研究料液比、超声提取时间和乙醇浓度对保健食品总黄酮提取量的影响。[结果]由正交试验数据分析可知，影响因素的主次顺序是料液比>乙醇浓度>提取时间。保健食品总黄酮在60%乙醇，料液比1：20，超声提取时间20min条件提取出的总黄酮含量最高，平均值为5.370mg，加样回收率为95%-104%，RSD为1.717%(n=5)。[结论]在最佳条件下进行的保健食品中总黄酮含量测定精密度高，回收率好，空白低且稳定。

　　关键词：保健食品;总黄酮;超声提取;正交试验法

　　Abstract:[Objective]To establish the optimum extraction situation of total flavonoids in health food.[Methods] Adopt the single-factor analysis and orthogonal test design to study the effect of solid-to-liquid ratio, ultrasonic time and ethanol concentration on the content of total flavonoids extraction in health food with the total flavonoids as inspection target.[Results] From the data analysis of the orthogonal test design it was known that the order of affecting coating thickness was ranked as the solid-to-liquid ratio> ethanol concentration> extraction time. The extraction of total flavonoids in health food was the highest under the situations of ethanol concentration 60%, solid-to-liquid ratio 1:20 and ultrasonic time 20min. The average content of total flavonoids was 5.370mg, the recovery was 95%—104% and the relative standard deviation was 1.717%(n=5). [Conclusion]The determination of total flavonoids has high accurancy and recovery under the optimum extraction situation, the blank is low and stable as well.

　　Key words: health food; flavonoids; ultrasonic extracion; orthogonal test design

　　黄酮是保健食品中的一类重要成分，功能为自由基清除剂。现代研究证明黄酮类化合物是重要的抗氧化剂，其生理作用是多种多样的，例如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩 ;杜鹃素具有止咳祛痰作用;黄芩苷具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞作用;水飞蓟素具有保肝作用等。此外，黄酮类化合物还有降血脂、止血、抑制血小板聚集等多种药理作用[1]。正是黄酮的上述生物活性，目前市场上含黄酮成份的保健食品的盛行。为了保证保健食品安全和质量，通过有效手段将这一类保健食品黄酮成份提取出来，进行准确定性定量检测非常重要[2]。

　　黄酮的提取方法有微波提取法、有机溶剂提取法、超临界萃取法、酶辅助提取法、超声波辅助提取法等[1]。近年来，超声波技术在天然产物提取中已显示出巨大的优势，利用超声波产生的强烈振动、空化效应、搅拌作用等可以加速保健食品有效成分进入溶剂，提高提取率，缩短提取时间，节省溶剂，简化提取操作步骤[3]。既适用于普通粉类样品，也适用于含油脂类较高的样品检测 。

　　本研究用单因素分析和正交试验，研究超声波提取保健食品中总黄酮类物质的最佳条件。提取后采用紫外分光光度法测定，其方法简便快速，准确精密，能满足保健食品检测的需要。

　　1 仪器与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　723型紫外可见分光光度计;DL-360型超声波振荡仪(浙江象山县石浦海天电子仪器厂，360W);分析天平;电热恒温水浴锅;玻璃器皿。芦丁标准品：纯度>98%(上海融禾医药有限公司);无水乙醇(A.R，重庆东方试剂厂);甲醇(A.R，重庆东方试剂厂);石油醚(A.R，北京长海化工厂);聚酰胺粉剂(14~30目)。

　　1.2 样品

　　样品：市场购买的苦荞茶商品。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 标准曲线

　　精密称取芦丁标准品0.0025g,用甲醇溶解，定容至50ml容量瓶中，制成芦丁标准储备液，避光冷藏保存。精密吸取0(空白)，1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00ml芦丁标准储备液于10ml具塞比色管试管中，用甲醇定容至10ml，配成质量分别为0、50、100、150、200、250、300、400μg的芦丁甲醇标准系列。用723型紫外可见分光光度计，1cm比色皿，于波长360nm处[4]，测定芦丁标准系列的吸光度值，以吸光度(A)为纵坐标，芦丁质量为横坐标，绘制标准曲线。得到芦丁标准曲线见图1。标准曲线回归方程为y=0.0033x-0.0109，相关系数为0.9995。

　　图1 芦丁质量—吸光度标准曲线

　　Fig.1 The content of Rutin-absorbency standard curve

　　1.3.2 样品处理

　　准确称取样品1.0g于研钵中，研磨后，装入25ml具塞比色管中，按试验要求加入一定量的不同浓度的乙醇，摇匀后，将具塞比色管置超声波振荡提取，静置后从中吸取1.00ml上清液，聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20ml石油醚洗脱杂质，然后用甲醇洗脱总黄酮，定容至10ml。

　　1.3.3 单因素分析测定

　　以保健食品总黄酮含量为考察指标，分别单独研究料液比、超声提取时间和乙醇浓度三个单因素对保健食品总黄酮提取量的影响。根据表1内容进行单因素实验测定，然后按样品处理操作，提取液于紫外分光光度计，波长360nm处测定其吸光度值，用标准曲线法定量，以确定正交试验参数范围。

　　表1.单因素分析测定实验

　　Table.1 The experiments of the single-factor analysis 固定因素 实验因素 水平 提取时间30min[5]

　　溶剂为无水乙醇 料液比 1：5 1：10 1：15 1：20 1：25 料液比1：20

　　溶剂为无水乙醇 提取时间 10min 20min 30min 40min 提取时间30min

　　料液比1：20 乙醇浓度 50% 60% 70% 80% 90% 100%

　　1.3.4 正交试验测定

　　在1.3.3的基础上，采用L9(34)正交表对料液比、提取时间、提取剂浓度进行超声提取保健食品总黄酮含量的正交试验。

　　1.3.5 精密度实验

　　在1.3.4正交试验得出的最佳条件下，样品用超声波提取后测定黄酮提取量，重复试验5次，计算保健食品总黄酮平均提取量。

　　1.3.6 回收率实验

　　分别取0.2g样品于两支15ml具塞比色管中,各加入4ml乙醇,其中一管加入100μg芦丁标准品作为加标测定管,另一管作为本底管，再按最佳试验条件进行处理样品，用标准曲线法进行计算，重复试验3次，计算回收率。

　　2.结果

　　2.1 单因素分析结果

　　2.1.1 料液比对黄酮含量的影响

　　由1.3.3单因素分析测定，固定提取时间和溶剂，改变料液比，实验结果见表2。

　　表2 料液比对总黄酮提取量的影响

　　Table.2 Extract results of flavonoids with the different solid to liquid ratio 液固比 1：5 1：10 1：15 1：20 1：25 样品吸光度 1.204 0.619 0.423 0.362 0.241 总黄酮量(mg) 1.841 1.909 1.972 2.260 1.908

　　从图2可以看出，料液比(固体样品质量与乙醇体积之比)达到1：20之前，随料液比的增大，黄酮提取率增大，料液比为1：20时，样品中总黄酮提取含量最高，超过1：20之后，开始降低。故提取时料液比最好控制在1：20左右为宜。

　　图2 料液比对黄酮含量提取的影响

　　Fig.2 Extract results of flavonoids with the different solid to liquid ratio

　　2.1.2 提取时间对黄酮含量的影响

　　由1.3.3单因素分析测定，固定料液比和提取溶剂，改变提取时间，实验结果见表3。

　　表3 提取时间对总黄酮提取量的影响

　　Table.3 Extract results of flavonoids with the different time 提取时间(min) 10 20 30 40 样品吸光度 0.164 0.280 0.351 0.338 总黄酮量(mg) 1.060 1.763 2.194 2.114

　　从图3可以看出，超声波提取时间在10min-30min时，随时间的增加，黄酮提取含量逐渐增加，30min之后，提取效果没有显著的变化，故一般选提取时间为30min为宜。

　　图3 提取时间对总黄酮提取量的影响

　　Fig.3 Extract results of flavonoids with the different time

　　2.1.3 提取剂浓度对黄酮含量的影响

　　由1.3.3单因素分析测定，固定提取时间和料液比，改变提取溶剂，实验结果见表 4。

　　表4 乙醇浓度对样品的影响

　　Table.4 Extract results of flavonoids with the different concentraction 乙醇浓度 50% 60% 70% 80% 90% 无水乙醇 样品吸光度

　　总黄酮量(mg) 0.780

　　4.794 0.835

　　5.368 0.648

　　3.994 0.562

　　3.472 0.439

　　2.726 0.356

　　2.224 由图4可见，当用60%乙醇作提取溶剂时，样品中总黄酮的提取效果最好。

　　图4 提取剂浓度对黄酮含量提取的影响

　　Fig.4 Extract results of flavonoids with the different concentraction

　　2.2 正交试验结果

　　根据单因素试验结果，对料液比、提取时间和提取剂浓度3个因素进行 L9(34)正交试验(见表5)，结果见表6、表7。

　　表5 因素与水平表

　　Table.5 Factors and levels 水平 因 素 A料液比 B提取时间(min) C乙醇浓度(%) 1 1：15 20 50 2 1：20 30 60 3 1：25 40 70

　　表6 正交试验结果

　　Table.6 The arrangement of factors and results 因素 结果 试验号 A料液比 B提取时间 C乙醇浓度 黄酮提取量 1 1 1 1 4.800 2 1 2 2 5.066 3 1 3 3 4.821 4 2 1 2 5.377 5 2 2 3 5.340 6 2 3 1 5.359 7 3 1 3 4.569 8 3 2 1 4.869 9 3 3 2 4.925 k1 4.896 4.915 5.009 k2 5.359 5.092 5.123 k3 4.788 5.035 4.910 R 0.571 0.177 0.213

　　表7 方差分析(完全随机模型)

　　Table.7 Variance analysis (complete stochastic model) 变异来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 A料液比 0.552 2 0.276 478.954 0.002 B提取时间 0.049 2 0.024 42.184 0.023 C乙醇浓度 0.068 2 0.034 58.940 0.017 误差 0.001 2 0.001

　　表7方差分析结果表明，各因素对试验结果均有显著影响。又由表6可知，因素主次顺序A>C>B，料液比对提取量的影响最大，其次是乙醇浓度，提取时间对提取量的影响最小。

　　由表6可知，在正交试验设计的范围内，最佳实验方案为4号试验(A2B1C2)，即料液比1：20，提取时间为30分钟，溶剂浓度60%乙醇。

　　2.4 精密度实验结果

　　由1.3.5精密度实验测定结果见表8。由表8可知平均提取量为5.370mg，标准偏差为0.0922，RSD=1.717%，证明实验精密度较好。

　　表8 保健食品总黄酮提取精密度试验

　　Table.8 The experiments of precision in health food 平行样号 1 2 3 4 5 吸光度 0.869 0.879 0.871 0.874 0.883 总黄酮量(mg) 5.332 5.394 5.344 5.364 5.418 =5.370mg S=0.0922 RSD=0.01717

　　2.5 回收率实验结果

　　由1.3.6回收率实验测定得到表9中数据。由表9可知，回收率为95%~104%，证明实验准确度很好。

　　表9 保健食品总黄酮回收率试验

　　Table.9 The experiments of recovery in health food 样品本底值(μg) 加标量(μg) 加标后测定值(μg) 回收率(%) 1079 100 1183 104 1063 100 1157 96 1084 100 1179 95

　　3. 讨论

　　本试验建立了以芦丁为标准品，用乙醇超声提取，紫外分光光度法测定保健食品中总黄酮含量的方法，本方法简便可行，精密度好，回收率好。通过单因素试验研究了各因素对总黄酮提取量的影响。正交试验表明影响黄酮提取量的因素主次顺序是：料液比>乙醇浓度>提取时间。正交试验确定了保健食品中总黄酮的提取最佳条件是：60%的乙醇，料液比1：20，提取时间20min。试验表明，该试验在最佳条件下，保健食品中黄酮提取量达到5.370mg。本法可用于保健食品和某些食品中总黄酮的检测。

　　参考文献

　　1. 佟永薇.黄酮类化合物提取方法的研究及展望[J].食品研究与开发. 2008,29(7):188

　　2. 刘建祥，李英 等.保健食品中总黄酮的提取及含量测定研究[J].食品研究与开发.2008, 29 (9):116

　　3. 王立升，刘力恒 ，黄仁彬.超声波提取小叶榕叶总黄酮工艺研究[J].食品研究与开发，2007，(12)：91—95

　　4. 肖香兰. 保健食品中总黄酮的测定方法[J]. 中国卫生检验杂志. 2007，17(6):1037

　　5. 李松青. 超声波提取分光光度法测定保健食品中总黄酮[J]. 中国卫生检验杂志. 2007，17(2):363