摘　要：研究了不同浓度的草甘膦处理液对鲫鱼肝细胞内膜系统以及谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶 (GOT)的影响。结果表明，随浓度的增加，肝细胞内膜系统中线粒体肿胀及空泡化、内质网空泡化、异噬型溶酶体增多。低浓度的草甘膦处理液对鲫鱼肝细胞中GPT、GOT活性起诱导作用,而高浓度则起抑制作用。建议以鲫鱼肝细胞内膜系统以及GPT和GOT活性变化作为水环境监测的生物指标，从而达到评价水生生态环境的目的。

　　关键词：草甘膦;鲫鱼;肝脏;内膜系统;谷丙转氨酶;谷草转氨酶

　　草甘膦(glyphosate)是一种高效、低毒的芽后除草剂，是我国目前出口量最大的农药品种,也是全球产量和销售量最大的农药品种。截至2006年底我国产能大约为30万吨[1],其大量使用给农业带来巨大效益的同时，也对土壤、水体及水体生物等造成了较大的污染。温州师范学院南旭阳曾报道过除草剂草甘膦对鲫鱼外周血红细胞微核及核异常的影响 [2]。耿德贵等研究草甘膦单独及联合作用时对中华大蟾蜍蝌蚪红细胞微核及核异常等遗传指标的上升[3]。Gary等报道草甘膦在体内与体外试验与DNA损伤[4]。因此研究草甘膦对水生生物的毒理效应，特别是利用生物标志物为指标，评价草甘膦对水生生态的影响具有重要意义。国内目前尚未追索到草甘膦对鲫鱼肝细胞内膜系统等方面影响的报道。本实验以5种不同浓度的草甘膦，研究其在不同处理时间对鲫鱼肝细胞内膜系统以及谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶 (GOT)活性的动态变化影响。旨在探索草甘膦对鲫鱼的毒害作用，从而为草甘膦的合理使用、保障渔业生产和生物安全性提供初步的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料与仪器

　　试验用健康鲫鱼购自滨州市六街水产市场，体重75.5±4.5g，体长9.4±2.0cm。草甘膦(草甘膦异丙胺盐，41%水剂)由上海惠光化学有限公司提供。谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶 (GOT)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。日产JEM—140a投射电镜观察，Gatan--792 CCD数字图象采集系统拍照。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 给药状态下肝脏GPT、GOT活力的测定

　　通过急性中毒实验，用蓝宇工作室Version1.01,LD50数据处理软件计算24h急性中毒试验的半数致死量为128.11mg/L,95%置信区间为(78.12——210.09mg/L)，48h中毒试验的半数致死量为48.96mg/L,95%的置信区间是(30.52——53.74mg/L)。安全浓度为1.50 mg/L。以急性中毒试验为依据，根据24h内鲫鱼不出现死亡和明显异常为标准，确定最高染毒浓度为5.12mg/L。以此为标准，按1/2浓度梯度递减，为2.56mg/L 、1.28mg/L、0.64mg/L、0.32mg/L、0.16mg/L共5个浓度组(1-5组)，每个浓度设2个平行。另设一不加草甘膦的对照组(0组)。每组均投放15尾鲫鱼，每24h更换一次处理液。在24h、48h、96h从每组取出4条鲫鱼，取其肝脏。肝脏匀浆的制备和GPT、GOT活力的测定均按照南京建成生物工程研究所提供的测试盒进行制备和测定。

　　1.2.2　肝细胞电镜切片的制备

　　在处理后96h随机抽取对照组和各浓度组鲫鱼一条，取其肝脏，用锋利剪刀剪下一小块组织，迅速放到滴有预冷固定液(2.5%戊二醛)的蜡片上，在固定液中用刀片把组织切成体积约1mm3小块，用牙签将3-5小块组织转移至含有2-3ml预冷固定液的干净青霉素小瓶内。然后置于4℃冰箱内保存备用。

　　2 结果与分析

　　2.1草甘膦对鲫鱼肝细胞内膜系统的影响

　　草甘膦对鲫鱼肝细胞线粒体、内质网、溶酶体等内膜系统的影响见图1、图2。

　　(a) (b) (c)

　　图1

　　(a)对照组：鲫鱼肝细胞中有丰富的粗面内质网和线粒体，线粒体嵴多、明显;(b)浓度1组：鲫鱼肝细胞中因应激反应线粒体、内质网增生;(c) 浓度2组：鲫鱼肝细胞中出现大量的异噬型溶酶体

　　(a) (b) (c)

　　图2

　　(a)浓度3组：鲫鱼肝细胞中线粒体肿胀、嵴明显减少;(b)浓度4组鲫鱼肝细胞中内质网空泡化;(c) 浓度5组：鲫鱼肝细胞中线粒体空泡化

　　线粒体是细胞内主要的能量形成所在, 是极为敏感的细胞器, 内质网参加蛋白质和脂质的合成、加工、包装和运输，是细胞中的重要细胞器之一，所以在生理上或病理上都具有十分重要的意义。 图1(a)中：线粒体的嵴清晰可见，(b)中：内质网明显比对照组(a)中丰富，(c)中：在(a)中极不多见的异噬型溶酶体明显增多。随着浓度的增加，图2(a)中：线粒体肿胀、嵴减少，(b)中：最明显的变化是内质网出现空泡，(c)中：线粒体也出现了空泡化。

　　2.2草甘膦对鲫鱼肝脏GPT活性的影响

　　经24h、48h、96h测定的GPT活性见表1。

　　表1 不同时间与不同浓度的草甘膦处理液条件下鲫鱼GPT活性

　　组别

　　24hGPT

　　活性

　　诱导率

　　(%)

　　48hGPT

　　活性

　　诱导率

　　(%)

　　96hGPT

　　活性

　　诱导率

　　(%)

　　0 50.6600 ±0.3801 0 51.1933±1.0854 0 55.2655±0.8008 0

　　1 60.2039±3.1145 18.84 62.7062±1.5896 22.49 69.1470±1.1428 25.12

　　2 61.7344±6.0430 21.86 71.6294±4.6444 39.92 81.2840±4.1087 47.08

　　3 74.0312±1.2351 46.13 78.6663±1.0884 53.67 85.0940±3.2838 53.97

　　4 77.1015±3.5256 52.19 85.8303±1.4735 67.66 111.3871±3.1561 101.55

　　5 87.1694±3.0891 72.07 93.2744±1.9377 82.80 89.1972±3.6689 61.40

　　经方差分析，浓度间(F=240.90,P<0.0001)、不同时间(F=95.04 , P<0.0001)、浓度与时间交互作用(F= 14.46 , P<0.0001)有统计学差异。对照组与各试验组GPT活性均有统计学差异(P<0.05),各试验组间GPT活性均有统计学差异;不同时间GPT活性差异有统计学意义(P<0.05)。

　　从相同时间段不同浓度来看，24h、48h处理的GPT活性均被诱导，GPT活性随污染物浓度的上升而升高， 96h处理的GPT活性先被诱导，而后慢慢诱导率降低，第5浓度组反而出现抑制，比第4浓度组诱导率低，但仍然高与对照组。从相同浓度不同时间段来看，除96h第5组外，GPT活性呈现随处理时间延长活性增大现象。

　　2.3草甘膦对鲫鱼肝脏GOT活性的影响

　　经24h、48h、96h测定的GOT活性见表2。

　　表2 不同时间与不同浓度的草甘膦处理液条件下鲫鱼的GOT活性

　　组别

　　24hGOT

　　活性

　　诱导率

　　(%)

　　48hGOT

　　活性

　　诱导率

　　(%)

　　96hGOT活性

　　诱导率

　　(%)

　　0 36.5981±0.3751 0 36.5558±1.6078 0 29.1952±0.7809 0

　　1 60.1095±2.6936 64.24 73.4152±8.0437 100.83 50.0919±7.3483 71.58

　　2 73.6094±0.8048 101.13 90.6657±11.3565 148.02 64.5965±3.4576 121.26

　　3 74.3611±4.7195 103.18 93.5938±0.5573 156.03 77.3178±4.4644 164.83

　　4 84.6431±1.6138 131.28 102.3203±4.1582 179.90 91.1601±4.3134 212.24

　　5 89.2032±5.6190 143.74 108.5325±5.4476 196.89 48.3390±3.9162 65.57

　　经析因设计的方差分析，不同浓度间(F=165.57,P<0.0001)、不同时间(F=110.92 , P<0.0001)、浓度与时间交互作用(F= 14.77 , P<0.0001)均有统计学意义。经两两比较，各实验组均与对照组差异均有统计学意义( P<0.05)，2、3、5组间无统计学差异，其他组均有统计学差异。

　　从相同时间段不同浓度来看，24h、48h处理的GOT活性均被诱导，GOT活性随污染物浓度的上升而升高， 96h处理的GOT活性先被诱导然后又转入抑制。从相同浓度不同时间段来看，GOT活性是先升高而后又降低，并且差异显著。

　　3 结论

　　3.1 根据透射电镜观察结果, 可以发现与对照组相比, 在浓度组鲫鱼肝细胞中出现了一系列的亚细胞结构形态病变。草甘膦处理液肝细胞变化主要表现为线粒体肿胀、空泡以及内质网空泡化, 这种核结构改变大多是细胞不可复性损伤的标志, 提示活体内细胞死亡或坏死的出现[5]。随草甘膦浓度的递增，亚细胞结构损伤程度也呈现渐进的变化：低浓度组，细胞中线粒体、内质网大量增生，说明了肝细胞受到草甘膦的低毒影响时，出现了暂时的应激反应。随浓度的增大，草甘膦中的有机成分被肝细胞吸收后，被溶酶体吞噬，而溶酶体不能对其消化分解掉，因而形成了大量的异噬型溶酶体，此种溶酶体的增多，将影响肝细胞的功能，进而线粒体、内质网出现空泡，最终导致肝细胞的损伤。

　　上述电镜观察结果显示，草甘膦可以直接作用于实验鲫鱼的肝脏，并引起显著的病理学变化，从而扰乱生物体正常的生理机能， 产生显著的中毒症状， 甚至导致死亡。

　　3.2 谷丙转氨酶和谷草转氨酶是广泛存在于动物体内的两种重要的转氨酶，参与蛋白质代谢。这两种酶活性高低反映出鲫鱼体内氨基酸代谢情况，同时反映出肝脏功能。肝脏是鲫鱼营养物质消化的主要腺体，也是尿素合成的主要场所，有解毒功能。谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著提高，能够加快尿素生成，减少氨基酸代谢产物对机体的毒害[6]。

　　通过谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性的测定，结果表明这两种酶的活性在24h、48h都明显高于对照组，说明短时间草甘膦处理可诱导这两种酶提高，加强对毒物的排出。96h处理组两种酶的活力都开始下降，并且随着浓度组的升高，活力也越来越小，到第5浓度组酶的活力已经明显地低于4组的活力。这说明肝细胞长期处于不良的状态下，功能开始下降[7]。

　　由此看出鲫鱼肝细胞的亚细胞结构改变以及GPT、GOT活性变化和草甘膦处理液浓度以及暴露时间存在一定的剂量、时间---效应关系。

　　参考文献：

　　[1]韦秋吉.2006年中国草甘膦行业状况分析[J].中国农药.2007，(1)28-30

　　[2] 南旭阳.除草剂“草甘膦”对鲫鱼外周血红细胞微核及核异常的影响[J] . 安徽师范大学学报(自然科学版)，2001，24(4)：329-331

　　[3] 耿德贵，刘文.除草剂盖草能对黄鳝外周血红细胞微核和核异常的影响[J].徐州师范大学学报(自然科学版)，2000，18(2)：53-55

　　[4] Gary MW，Robert K，Ian CM. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide roundup and its active ingredient，glyphosate，for humans[J] . Regul Toxicol Pharmacol，2000，31(2)：117-165

　　[5] 周群芳，傅建捷，孟海珍等.水体硝基苯对日本青鳉和稀有鮈鲫的亚急性毒理学效应[J] .中国科学，2007,37(2):197-206

　　[6] 赵 杰，谷子林，崔青曼等.“克白克"对中国对虾体内琥珀酸脱氢酶、磷酸甘油三酯和谷草转氨酶活性的影响[J] .中国饲料，2002，3：31-32

　　[7] 汪开毓，耿 毅，钟妮娜.鱼类应激性