摘要：β-葡萄糖醛酸酶(β-G)是大肠杆菌(E.coli)的特异酶，本文利用酶-底物法测定β-G活性，确定了β-G的最佳发酵培养基：胰蛋白胨 1%、淀粉 5%、Nacl 0.5%、酵母膏 0.5%、pH 7.2～7.4;最佳发酵培养条件：通气量 50ml/250ml三角瓶，转速 110rpm，并用硫酸铵分级沉淀法对β-G进行提取研究。

　　关键词：β-葡萄糖醛酸酶;发酵;培养条件;优化;提取

　　食品卫生和食品安全关系到人民群众的身体健康和生活质量，关系到我国经济发展和社会稳定的一件大事[1]。β-G是一种酸性水解酶，特异地富含于大肠杆菌中，国外早在八十年代初开始将β-G的检出用于判断大肠杆菌的存在，该法具有快速、特异性强、价格低廉、灵敏度高等优点，不仅用于大肠杆菌的快速定性检测，还可达到定量检测。大肠杆菌作为一种危害性较强的致病菌，对于人类的身体健康构成了很大的威胁，因此大肠杆菌快速检测对于保障人类的身体健康具有重要的意义[2]。

　　1材料与方法

　　1.1 材料

　　大肠杆菌 天津公安医院;蛋白胨 天津英博生化试剂有限公司;琼脂条 北京化学试剂公司;琼脂粉 日本进口分装;酵母浸膏 天津英博生化试剂有限公司;甘油磷酸钠 中国医药上海化学试剂公司;无水葡萄糖 天津市北辰液化化学试剂厂;胰蛋白胨 北京双旋微生物培养基制品厂;硫酸铵 天津天大化工实验厂;乙醇 天津天大化工实验厂;磷酸 天津四通化工厂;考马斯亮蓝G-250 Amresco公司;对硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷 天津市医药科学研究所。

　　1.2仪器与设备

　　蒸汽消毒器 山东新华医疗器械厂; YP型电子天平 上海天平仪器厂;752分光光度计 上海光谱仪器有限公司;TG328A分析天平 上海天平仪器厂;95-1磁力搅拌器 上海司乐仪器厂;HYG-II回转式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司;LSY电热恒温水浴锅 北京医疗设备厂;PHSJ-4A型pH酸度计 美国奥立龙公司;BS-自动部分收集器 上海沪西分析仪厂;BT00-300M流量调节器 保定兰格恒流泵有限公司;LRH-250-A生化培养箱 广东省医疗器械厂。

　　1.3 方法

　　1.3.1大肠杆菌生长曲线的测定

　　1.3.1.1 接种

　　取大肠杆菌斜面培养基1支，以无菌操作挑取适量菌苔(两环)，接入种子培养液中。

　　1.3.1.2校正零点

　　将蒸馏水倾倒入比色皿中，选用650nm波长分光光度上调节零点，以作测定的空白对照。

　　1.3.1.3测零时OD值

　　将刚接入大肠杆菌的但未振荡培养的培养基倾倒入比色皿中,在校好零点的分光光度计上测定O.D值。此时的O.D值即为接种后大肠杆菌生长曲线中的零时读数值。

　　1.3.1.4 振荡培养

　　将接过种的三角瓶放入自控恒温汽浴摇床上振荡培养，温度为37℃，转速110rpm。

　　1.3.1.5 生长量测定

　　在培养过程中，每隔2小时从摇床上取下一瓶装有培养基的三角瓶，将培养基倒入比色皿中，并在分光光度计上读取OD值。

　　1.3.2 β-葡萄糖醛酸酶提取

　　将E.coli振荡培养6小时至酶活高峰，停止培养，按下面工艺进行提取[4]。

　　2 结果与讨论

　　2.1大肠杆菌生长曲线的测定

　　实验将E.coli接种于种子培养基中以培养时间为横坐标，测得的OD值为纵坐标，绘制E.coli生长曲线如图1。

　　图1 E.coli的生长曲线

　　Fig 1 The growth curve of E.coli

　　从图1可以看出0～4小时为迟缓期，4～10小时为对数生长期，10小时以后，菌体的生长进入稳定期。

　　2.2 β-葡萄糖醛酸酶活性测定

　　2.2.1 底物选择

　　天津医药科学研究所于2000年合成了对硝基酚-β-葡萄糖醛酸苷(PNPG)，纯度与Sigma公司PNPG相比略高，且价格不足Sigma公司价格的十分之一，因而选择PNPG为底物。

　　2.2.2 测定原理[5]

　　β-葡萄糖醛酸酶

　　对硝基苯基-β-葡萄糖醛酸苷钠盐 对硝基酚 +β-葡萄糖醛酸苷钠盐

　　大肠杆菌所具有的葡萄糖醛酸酶水解对硝基苯基-β-葡萄糖醛酸苷钠盐，游离出的对硝基酚呈黄色，可用分光光度计在405nm波长处测定。

　　2.3β-葡萄糖醛酸酶活性测定

　　2.3.1 发酵培养基的优化

　　2.3.1.1 碳源的选择

　　原发酵培养基：酵母膏0.5%、蛋白胨1%、Nacl 0.5%、pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min。在原发酵培养基的基础上，选用淀粉、甘油磷酸钠和葡萄糖作为碳源，添加量为5%;发酵液 50ml/250ml 三角瓶。37℃水域振荡培养(110rpm)，于6小时取样检测，结果见图2。

　　1260

　　377

　　20

　　0

　　200

　　400

　　600

　　800

　　1000

　　1200

　　1400

　　淀粉

　　甘油磷酸钠

　　葡萄糖

　　酶活(U)

　　图2 碳源对产酶的影响

　　Fig2 The influence of Carbon source Producing enzyme

　　由图2可以看出淀粉为该菌产酶的最佳碳源，甘油磷酸钠次之，对葡萄糖的利用能力较差。在实验中,淀粉的成本较低,选取添加量为5%的淀粉作为优化后的碳源。

　　2.3.1.2 氮源的选择

　　原发酵培养基：酵母膏0.5%、淀粉5%、Nacl 0.5%、pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min。在原发酵培养基的基础上，选用蛋白胨、胰蛋白胨和大豆蛋白作为氮源，添加量为1%、发酵液 50ml/250ml 三角瓶。37℃水域振荡培养(110rpm),于6小时取样检测,结果见图3。

　　图3 氮源对产酶的影响

　　Fig 3 The influence of Nitrogen source Producing enzyme

　　由图3可以看出胰蛋白胨是比较适合该菌产酶的氮源。 在实验中,选取添加量为1%的胰蛋白胨作为优化后的氮源。

　　通过实验可得优化发酵培养基：酵母膏0.5%、胰蛋白胨1%、Nacl 0.5%、淀粉5%、pH 7.2～7.4。

　　2.3.2 发酵培养条件的选择

　　2.3.2.1通气量对产酶的影响

　　在250ml三角瓶中分别装入30ml、50ml、70ml优化发酵培养基,按2%的接种量接种。于110 rpm旋转水域摇床37℃振荡培养，在6小时取样，4℃下离心，转速为3000rpm，离心15 min，除去菌体。用对硝基酚-β-葡萄糖醛酸酐酶底物法测上清的酶活力见图4。

　　图4 通气状况对产酶的影响

　　Fig 4 The influence of Ventilation conditions Producing enzyme

　　由图4可以看出，发酵液体积越大，即通气量越小时，发酵液中酶活力越高，但它们彼此之间相差不是很明显。发酵选择50ml/250ml瓶的装液量。

　　2.3.2.2 摇床转速对产酶的影响

　　在250ml三角瓶中装入50ml优化发酵培养基,按2%的接种量接种。分别于110 rpm、170 rpm、210 rpm旋转水域摇床37℃振荡培养。在6小时取样，4℃下离心，转速为3000 rpm ，离心15 min，除去菌体。用对硝基酚-β-葡萄糖醛酸酐酶底物法测上清的酶活力见图5。

　　图5 摇床转速对产酶的影响

　　Fig5 The influence of Rotation speed Producing enzyme

　　由图5可以看出，转速的改变对产酶的影响不是很明显，，选择110 rpm旋转水域摇床37℃振荡培养。

　　通过实验可得优化发酵培养条件为：发酵选择50ml/250ml瓶的装样量，110 rpm旋转水浴摇床37℃振荡培养。

　　2.4 β-葡萄糖醛酸酶的提取

　　2.4.1 提取原理

　　实验提取β-G的工艺是利用硫酸铵对蛋白质的沉淀作用。提取过程中使用2次硫酸铵，首先使用饱和硫酸铵沉淀蛋白，然后采用30～45%饱和度的硫酸铵分组沉淀;从培养液中分离菌体时，采用转速3000rpm,15min;沉淀的溶解使用少量的1/15mol/L pH8.0 PBS磷酸盐缓冲液;在4℃下透析脱盐获得纯品。

　　2.4.2 β-G提取回收率与提纯倍数

　　β-G为可溶性蛋白，所以测定蛋白的方法选用考马斯亮蓝G-250法，提取纯化的回收率与提纯倍数测定结果见表1。

　　表1 β-G提取纯化

　　Table 1 β-G extraction and purification

　　指 标

　　总蛋白(mg)

　　总活力(U)

　　比活力(U/mg)

　　提纯倍数

　　回收率(%)

　　提取前

　　提取后

　　2316

　　1324

　　0.57

　　1

　　100

　　370

　　680

　　1.84

　　3.2

　　51.3

　　3 结论

　　3.1最佳发酵培养基：胰蛋白胨 1%、淀粉 5%、Nacl 0.5%、酵母膏 0.5%、pH 7.2～7.4;

　　3.2 最佳发酵培养条件：发酵培养基的装液量为50ml/250ml三角瓶，110rpm振荡培养;

　　3.3采用硫酸铵对β-G进行粗提，提纯倍数3.2，回收率51.3%。

　　参考文献：

　　[1]聂凌鸿.微生物污染与食品安全[J],四川食品与发酵,2003,(2):52-55.

　　[2]徐茂军.基因探针技术及其在食品卫生检测中的应用[J].食品与发酵工业，2000，(2)：66-70.

　　[3]孙家莉,王文彤.酶-底物PNP-Glucu Na的合成及快速检测的应用[J].化学通报,2000，(3):45- 48.

　　[4]孙家莉.对-硝基苯葡糖苷酸钠纸片法快速检测大肠埃希菌.中国检验医学杂志，2001，(3):168-170.

　　[5]潘宝海.对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖法测定饲用α-半乳糖苷酶活力的方法[J].中国农业大学学报，2002，(5):107-111.