[摘要]目的:探讨蛋白芯片技术用于初步筛选息肉状脉络膜血管病变(PCV)血清特异性蛋白的可行性。方法:采用Raybiotech 公司生产的AAH-BLG-507 芯片试剂盒，检测随机抽取的1 例阴性对照组、2 例PCV 患者血清中相应蛋白的表达水平，分析差异性表达蛋白之间的关系。结果:AAH-BLG-507 蛋白芯片检测结果发现58 种在PCV 患者血清中呈上调趋势，21 种呈下调趋势。分析表达差异性蛋白之间关系显示主要分为细胞因子、趋化因子、胞外基质蛋白/基质金属蛋白酶、生长因子及新生血管相关因子及其受体4 大类。结论: 蛋白芯片技术是一种快速、简便的高通量蛋白质组研究方法，为PCV 研究提供了新的研究策略。

　　[关键词] 息肉状脉络膜血管病变; 蛋白芯片;蛋白质组学

　　息肉状脉络膜血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)是一种可引起严重视力损伤的眼底疾病，其致病因素多与视网膜病变、AMD、局限性脉络膜血管瘤、病理性近视及高血压、炎症、吸烟等相关[1-4]，但其病因和发病机制尚不明确。近年来，蛋白组学在眼底疾病中的研究也越来越受到重视，并已初步探明了 AMD 和 CNV的血清特异蛋白[5]，但对PCV的血清研究较少。因此，本研究利用蛋白质芯片技术初步筛选出与 PCV相关的特异性蛋白, 以期为临床早期筛查、监测PCV疾病发展及治疗等提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　所有研究对象均来自于 2014 年 12 月至 2016 年 6 月武汉大学人民医院眼科门诊及病房住院患者。PCV 患者经常规眼科检查、ICGA 及OCT 等确诊，具体诊断标准参考 2013 年 Koh 报道的专家共识[6]，阴性对照组选取无眼底疾病的白内障患者。必须未经过与眼底疾病有关的治疗，如 PDT、抗 VEGF 等且排除下列疾病：系统性疾病史如高血压、糖尿病，感染性或自身免疫性疾病，曾经患过肿瘤、血液病、肝病、肺病、心血管疾病，包括冠状动脉疾病、中风、周围动脉疾病或近 6 个月有手术史等。

　　1.2 蛋白芯片检测

　　采用 Raybiotech 公司生产的 AAH-BLG-507 芯片试剂盒，检测随机抽取的 1 例阴性对照组及 2 例 PCV 患者血清中相应蛋白的表达水平，分析差异性表达蛋白。实验操作按试剂盒说明书标准操作流程进行。

　　1.3 蛋白芯片数据处理

　　检测的荧光信号值包括荧光信号、背景及噪音等。数据分析时，一般使用去除背景的荧光信号进行分析，荧光信号的强弱反应了该种因子的表达量的高低。计算扣除背景荧光信号值及均值，再将 507 个因子分别统一化处理得到相应的数值，再根据需要进行组间比较，得到有表达差异的因子。

　　1.4 统计学分析

　　所有数据采用 SPSS20.0 统计软件进行分析，结果采用均数±标准差(Mean±SD)表示，两组间因子的比较是两组独立样本均值的比较，采用两个独立样本的 t 检验进行统计学分析。两组患者年龄的比较，采用的是两个独立样本的 t 检验进行分析。两组间性别构成的比较，采用的是四格表资料的卡法检验进行分析。显著性检验均以P<0.05 认为具有统计学意义。

　　2.结果

　　2.1蛋白芯片检测结果

　　Raybiotech 公司提供的蛋白芯片，在应用的过程中，能排除相邻孔之间的相互影响，且背景荧光值和噪音值较低，检测灵敏度高，最低检测量可达 pg/mL 级别。

　　2.2 蛋白芯片扫描荧光信号强弱情况

　　1 例阴性对照组血清样本及 2 例 PCV 患者血清样本，利用蛋白芯片 AAH-BLG-507 检测时扫描的荧光信号强弱结果，见图 1。荧光强度越大，表达的量越高。

　　N1 P1 P2

　　图1 1 例阴性对照组(N1)及2例 PCV 患者(P1、P2)蛋白芯片扫描的荧光信号

　　2.3 蛋白芯片靶蛋白的比较分析结果

　　蛋白芯片扫描后，检测荧光信号值扣除背景荧光，统一化处理后得到相应的数值，对比分析结果显示，有 79 个蛋白存在表达差异，其中 58 个靶蛋白表达增加，21 个靶蛋白表达降低，进一步分析了这些异常表达的蛋白之间的关系及功能属性，结果表明这些变化的蛋白主要分为细胞因子、趋化因子、胞外基质蛋白/基质金属蛋白酶、生长因子及新生血管相关因子及它们的受体四大类，因子间相互关系(具体见图 2)。

　　图 2 PCV 患者血清差异表达蛋白的相互关系及功能分类。将79个变化的蛋白

　　输入string-bd数据库(http://string-db.org/)分析(默认参数)，获得上述关系图。

　　讨 论

　　PCV 在我国老年患者中较为常见，且发病率呈逐年升高的趋势，且对患者视功能损害严重，已有的诊断和治疗方法尚存在一定的缺陷[7-8]。如何利用现代新兴的科技方法和手段对 PCV 的发病机制进行深入研究，寻找新的诊断标志物和药物新靶点，完善诊疗措施，为提高患者生活质量，是眼科尚待解决的一个难题。蛋白质组学可从蛋白分子水平筛选、分离、鉴定与疾病相关的特异性表达蛋白表达及活动规律，有助于深入探索疾病发生机制，便于早期诊断、病情监测、药物研发和预后评估，提高临床诊疗水平[9-10]，广泛地应用于肿瘤标志物的筛选[11]。故本研究采用蛋白质组学技术用于初步筛选PCV血清特异性蛋白，探讨其可行性。

　　本研究采用AAH-BLG-507 蛋白芯片全面分析 PCV 的蛋白表达水平，结果显示有差异性表达的因子有 79 个，主要包括细胞因子及其受体如白细胞介素类、TNF 及 TNF 超家族等;趋化因子及其受体如 CXCL11、CCL22、CCR5 等;胞外基质蛋白/基质金属蛋白酶及其抑制剂如细胞间黏附因子 1(intercellular celladhesion molecule 1, ICAM 1)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)及组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1, TIMP-1)等;生长因子及新生血管相关因子如表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、VEGF等四大类。

　　有研究发现VEGF 在 PCV 患者体内明显增高，给予玻璃体腔注射抗VEGF 药物有一定的疗效[12-13]。本研究蛋白芯片的结果中血管生长因子在 PCV 患者外周血中也是呈上升趋势，进一步证实 VEGF 参与了 PCV 新生血管形成。有学者通过研究对照组、AMD患者及 PCV 患者血清中几种 MMPs 的浓度，发现 PCV 患者血清 MMP-2 和 MMP-9明显升高[14]。本研究蛋白芯片检测结果也显示 PCV 患者血清中 MMPs 表达升高，也佐证了 PCV 的形成可能与 MMPs 相关。有发现某些细胞因子和趋化因子在 PCV 发病过程中眼局部会发生动态变化 [12,15]，而关于 PCV 患者外周血中细胞因子及趋化因子的研究，国内外罕有相关文献报道。

　　因此，我们还需继续扩大样本应用液相芯片等技术对 AAH-BLG-507 蛋白芯片中有差异性表达的细胞因子、趋化因子等进行探寻和验证，以期对 PCV 的发生机制有进一步研究和认识。

　　综上所述，蛋白芯片技术是一种快速、简便的高通量蛋白质组研究方法，可为 PCV 研究提供新的研究策略。

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